脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

ニューロン ネットワーク活動への貢献はそれが受け取るシナプス入力の動的な性質によって決まります。伝統的に、シナプス電流通路の軸索の電気刺激による誘発の体全体セル ホールセル記録するニューロンのシナプスの特性の優勢な方法に依存。ただし、近位に位置するシナプスの唯一の活動は正直このケース¹で報告されます。さらに、シナプス固有のメカニズムを評価するためにニューロンのペアから、特定の場所に樹状突起からの録音はそれぞれ関心のシナプスと樹状突起の統合のメカニズムをターゲットに使用されています。画期的シナプスの生理学の分野では、光学的および電気生理学的手法の結婚によって達成されました。2 光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) Ca^{2 +}イメージングと光遺伝学的ツールとの組み合わせでシナプスで脳スライスで特定の神経接続でのダイナミックな組織の途方もない詳細が明らかに体外とin vivo。

複数の主利点を作った 2PLSM、従来の 1 光子励起顕微鏡²から目立つ: (1) 二光子励起の非線形性質のため、蛍光が焦点のボリュームでのみ生成され、すべて放出される光子を表す有用な信号 (ピンホールのない必要);(2) より長い波長、2PLSM で使用される浸透散乱組織より効率的に;さらに、光子、2 光子励起とバック グラウンド蛍光; あまりにも希薄(3) 生成や毒性また焦点平面に制限されます。したがって、従来の共焦点顕微鏡と比較すると 2 光子システムの高コストは、にもかかわらず、2PLSM 太い生体組織における神経細胞の構造と機能の高解像度の調査のための選択の方法のまま。

散乱体内の 2PLSM の最初のアプリケーションは、樹状突起スパイン³の機能と構造のイメージをだった。Ca^{2 +}イメージングとの組み合わせで 2PLSM として分離された生化学的なコンパートメントで棘関数を明らかにしました。以来、さまざまな神経棘と個々 のシナプス⁴の間の一対一の対応がある、二光子励起 Ca^{2 +}イメージングすぐになった便利なツールそのまま組織^{5、個々 のシナプスの活動報告 6,7,8}。さらに、2PLSM ベースの Ca^{2 +}イメージングがうまく使われた単一カルシウム チャネルおよび組み込みとシナプスのコンダクタンスの非線形相互作用の活動を監視するし、状態とアクティビティに依存を評価するにはCa^{2 +}シグナル神経樹状突起^{5,6,7,8,9,10,11}の規則。

ユビキタス細胞内二次メッセンジャーであり、その細胞内の時空間的構成イオンの調節するシナプス強度の変化からの生理学的反応の方向を決定するカルシウム チャネル、デンドライトと背骨の成長としてなく、細胞死、生存。複数経路の活性化を介して樹状 Ca^{2 +}上昇が発生します。活動電位 (Ap)、樹状突起を逆伝搬は、電位依存性カルシウム チャネル¹²を開き、樹状突起と棘¹³で比較的大域的な Ca^{2 +}トランジェント (猫) を生成します。シナプス伝達はシナプス後 Ca^{2 +}活性化に関連付けられて-透水性受容体 (NMDA、Ca^{2 +}-透水性 AMPA とカイニン酸)、^6、14,15猫シナプスのトリガーします。最後に、特定の条件^11,12,13,16の下で樹状突起で超直線性 Ca^{2 +}イベントを生成できます。

パッチ ・ クランプ記録との組み合わせで二光子励起 Ca^{2 +}イメージングを採用しています合成 Ca^{2 +}-通常は全細胞記録中にパッチ電極経由で配信される機密の蛍光インジケーター.Ca^{2 +}動態の定量化のための標準的な方法は、デュアル表示法^17,18に基づいています。よく分離発光スペクトルと 2 つの同時を使用して (例えば、赤い Ca^{2 +}の組み合わせ-緑の Ca^{2 +}インジケーター オレゴン グリーンこれら 1、蛍光色 4 などと区別しない染料) に比べていくつかの利点があり、単一指示薬法。最初に、Ca^{2 +}-に依存しない染料を使用、Ca^{2 +}イメージングを実行する (樹枝状の枝、棘) 興味の小さい構造を検索します。第二に、緑と赤の蛍光 (ΔG/R) の変化比が大きく変動する [Ca^{2 +}]₀¹⁷ベースライン蛍光の変化に敏感である [Ca^{2 +}]、メジャーとして計算されます。^,18します。 さらに、蛍光変化は^{絶対 Ca 2 +}濃度¹⁹面でキャリブレーションできます。

急性スライスで二光子励起 Ca^{2 +}イメージング実験を実行する場合の一般的な心配は細胞の健康と高レーザー出力の通常使用による画像取得の安定性。さらに、Ca^{2 +}イメージング実験である摂動法と細胞内 Ca^{2 +}動態の実質的な過大評価懸念 Ca^{2 +}インジケーターとして高度なモバイル外因性 Ca^{2 +}という事実のためにバッファー。したがって、Ca^{2 +}インジケーターとその濃度の選択は、神経型、猫の予想される振幅と実験の質問によって異なります。

我々 は樹状突起における gaba 作動性介在ニューロン^{9,10、11,20,21} Ca^{2 +}変動の調査の 2 光子励起 Ca^{2 +}イメージング法を適応^,22. 抑制介在ショーケース多種多様な錐体細胞²⁰のそれらとは異なる機能性の Ca^{2 +}メカニズムの初期 Ca^{2 +}イメージング研究の大部分は、主ニューロンで行われた中、^,23,24. これらの介在ニューロン固有のメカニズム (例えばCa^{2 +}透過性 AMPA 受容体) は、細胞活性の調節に特定の役割を果たすことがあります。二光子励起 Ca^{2 +}イメージングでこれらの細胞の樹状突起が薄く直径樹状突起と棘の欠如から、追加の課題を提示樹状 Ca^{2 +}シグナル介在ニューロンは詳しい調査のための魅力的なターゲットが、特に内因性 Ca^{2 +}結合能力が高い。私たち研究の海馬介在の研究の焦点、次のプロトコル間異なる神経細胞の集団に適用したこれらの課題に対処する適応

このプロトコルは、2 つの外部の非 descanned 探知機 (NDDs)、電気光学変調器 (EOM) とグラデーション コントラスト (SGC) をスキャン Dodt を装備され、光学テーブルにインストールされて商業共焦点 2 光子顕微鏡、実行されました。顕微鏡 800 モード同期チタンサファイアレーザー多光子と結合されていました (> 3 W、140 の fs パルス、80 Hz の繰り返し率) の nm。イメージング システムは、温度制御、2 つのマニピュレーターを持つ翻訳プラットフォーム、コンピューター制御電極アンプ、デジタイザー、刺激と灌流チェンバを含む標準的な電気生理学のリグが装備されていた単位、およびデータ集録ソフトウェア。