Долгосрочные последствия поведенческих и репродуктивного эмбриональных воздействия низких доз ядовитых веществ
Summary
Воздействие экологических токсикантов остро может влиять на развитие с долгосрочными последствиями. Подробные протоколы предоставляются для иллюстрации стратегии с использованием модели эффективной лаборатории для изучения влияния ранней эмбриональной воздействия бисфенола а. Мы предоставляем плодовитость и поведенческих анализов для мониторинга эффективности нашей экспозиции токсиканта био-анализов.
Abstract
Бисфенолов, таких как бисфенол А (BPA) и бисфенола S (BPS) полимеризовать агентов, широко используется в производстве пластмасс и многочисленные продукты каждый день. Основываясь на их химической структуры и эстрадиол как биологические свойства, они были классифицированы как эндокринной системы, нарушения соединения (EDC). Долгосрочное воздействие даже при низких дозах, в ЭЭС, были связаны с различные дефекты здоровья, включая рак, поведенческих расстройств и бесплодия, с большей уязвимости, указано в ранние периоды развития. Клеточной и молекулярной исследования с моделью генетически шансов справиться с возникающими нематоды Caenorhabditis elegans показали, что воздействие BPA вызывает апоптоз, эмбриональных летальность и потрясений в ДНК восстановительные механизмы. Мы уже ранее сообщали что воздействие C. elegans эмбрионов для низких доз различных бисфенолов уменьшает плодовитость. Кроме того мы показали, что последствия воздействия на самых ранних этапах развития сохраняются в зрелом возрасте, как анализ путем определения количественных показателей привыкание поведение, форма ассоциативные обучения. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для эмбриональных воздействия низких доз ЭЭС, а также связанные плодовитость и передней сенсорных привыкания анализов, наряду с представителем результаты.
Introduction
Воздействие экологических токсикантов, особенно соединений, которые склонны вмешиваться с развитием, является предметом тщательного научного изучения в последние годы. Более тысячи химических веществ в быту, классифицируются как эндокринной системы, нарушения соединения (EDC)1. Были отмечены периоды быстрого роста и развития, которые включают эмбриональных, грудных детей и детства этапов, особенно уязвимыми для пагубных последствий для EDC даже низкие дозы. Их влияние было показано, что причиной репродуктивной и нервной расстройств2. С требованиями агентства по охране окружающей среды США и нас Национальной токсикологической программы группа низкой дозы может определяться как любая доза ниже уровня одной, что было сообщено вызывают происходящие биологические изменения или повреждения3. Помимо низкой дозы воздействия отдельных ЭЭС смеси различных ЭЭС, найденных при низких концентрациях в окружающей среде имеют потенциал причинить основной кумулятивный эффект4.
Бисфенол А (BPA или 4,4′-(propane-2,2-diyl)) является агентом полимеризации в часто используемых элементов, таких как бутылки воды, хранить квитанции, стоматологическая герметиков и накладок напитки и еда канистры5. Благодаря его структурное сходство эстрадиол 17-β (E2) и его близость к ERα и ERβ рецепторами эстрогена BPA классифицируется как эндокринной, нарушая химические (EDC)5,6. Хотя слабее, BPA в близость с рецепторами эстрогена было показано влияют репродуктивной системы обоих полов и нарушить нейронные функции в дозах, которые считаются безопасной7,8. Наблюдаются изменения в метилирование ДНК через эпигеномно регулируемых механизмов вызывают долгосрочные нейрональных дефекты в мышей, воздействию BPA9. В частности BPA также был вовлечен как возможные виновником увеличения ставок гиперактивность, дефиците внимания и повышенная чувствительность к препаратам за счет увеличения, видели в D1 дофаминовых рецепторов в лимбической мозга мыши после хронического воздействия 9 , 10. существенные доказательства о пагубных последствиях ЭЭС на здоровье человека основывается на исследованиях корреляции, направленных главным образом на хроническое облучение населения для экологических токсикантов даже при низких дозах5; Однако решая критика необоснованные шумиха11,12были приняты ограничения в выводы из исследований человека и манипулирования экспериментальных элементов управления.
Благодаря сохранению генов Caenorhabditis elegans отношении млекопитающих, в том числе его гены стероидных гормонов рецептор, исследователи использовали этот генетически шансов справиться с возникающими лаборатории модель разгадать функциональные и механистические эффекты ЭЭС 13. эксперименты с C. elegans показали, что эти соединения, как BPA и BPS может вызвать apoptosis, эмбриональных летальность, нарушение в двуцепочечной ДНК перерыв ремонт механизмов и нейронные функции14,15 ,16.
Наша лаборатория ранее показал, что даже низкие дозы облучения, ограниченный в раннем эмбриогенезе приводит к снижению плодородия с поведенческой дефицита в живых взрослых15. Привыкание к неоднократные стимулом является формой ассоциативные обучения в модели систем, включая C. elegans, и наша методология использует эту форму ассоциативные обучения как поведенческих вывода для анализа долгосрочного воздействия эмбриональных подверженности токсикантов17 конкретно, мы предоставляем подробные протоколы для изучения воздействия BPA на C. elegans, включая его немедленное воздействие на эмбриональных летальность и долгосрочное воздействие на поведение взрослых, с общей схемы, изображенные в Рисунок 1. Представитель результаты от плодородия и анализов ассоциативные обучения предоставляются подчеркнуть эффективность нашей методологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Фазы быстрого роста и развития таких эмбриогенеза особенно уязвимы к пагубные последствия различных соединений, эндокринные нарушения, в том числе BPA. Мы предоставляем подробные протоколы для изучения последствий воздействия BPA или других токсикантов в C. elegans беспозвоночных модели, которая позволяет удобно титрование диапазон концентраций, для того, чтобы оценить его влияние на жизнеспособность эмбриона (рис. 2) . Последующие поведенческих эксперименты на живых взрослых, которые развиваются из эмбрионов, что были подвержены низких доз BPA позволяют опробование долгосрочное воздействие на функции нейронов (рис. 3). Центральная идея настоящего документа-представить подробные протоколы для разоблачения эмбрионов для различных токсикантов в ранний период эмбриогенеза в C. elegans модели; первые 4 ч окно его 11,5 часового периода эмбрионального развития (при 20 ° C) соответствует периода распространения, который сопровождается органогенеза. С этой целью мы предоставили проверки конечных точек через плодовитость и ассоциативные обучения анализов. В то время как механистической основой действий АДС и другие бисфенолов является Святой Грааль, к которой направлена исследования в этой области, у нас не попытка предложить механистическое объяснение действий АДС в этой статье целенаправленной методологии. Однако мы хотели бы указать на то, что модель C. elegans предлагает идеальную систему для дальнейшего изучения механизма действия. Например, в ходе будущей работы по расшифровке механизмы действия BPA C. elegans мутанты могут быть сгенерированы и проверку на стойкость к воздействию BPA и таким образом почву для расшифровки путь. Кроме того наши компаньоны рассматривается воздействие BPA на уровне одновременности нейронной сети в позвоночных, предоставляя другой авеню, чтобы понять основы для изучения потенциальных механизмов токсиканта эффекты19.
В методологии, подробно изложены в настоящем документе, некоторые из важных шагов, которые должны быть казнены загородный тщательно включают следующее: выбор плита с откормленными C. elegans взрослые зрелые яйца видны под микроскопом рассечение имеет решающее значение, и неспособность следовать этот шаг приведет к недостаточной выборки эмбрионов для EDC экспозиции эксперимента. Важно также, чтобы убедиться, что раствор гипохлорита сделан свежий во избежание получения несинхронизированные населения, что будет мешать способности выполнять BPA Выдержка в течение начале эмбриогенеза. Гранулы с M9 (после воздействия гипохлорита) это также очень важный шаг. Если не сделано должным образом, высокая концентрация отбеливателя может привести к мертвых зародышей. Кроме того эмбрионы должны передаваться в сеяный NGM пластины после 4 ч. Если оставить в решении BPA для длительного периода времени, эмбрионы могут развиваться в долгоживущих dauer личинок. Это значительно будет мешать плодовитость пробирного и поведенческих анализов. Если любой из этих шагов является пропустили, желательно, чтобы начать процедуру с самого начала. Если по любой причине, NGM пластины с глистами загрязнена или не имеют достаточного количества продовольствия, он будет добавить стресса на червей, тем самым наклон собранных данных. Такие плиты должны быть отклонены и не использоваться в эксперименте.
Ранее замечательное исследование успешно используется в C. elegans модель продемонстрировать, что хромосомные нарушения, вызванные BPA результат из-за распада ДНК ремонт техники в микрофлорой14. Однако стоит отметить, что выше дизайн исследования использовали непрерывное воздействие BPA C. elegans высоких доз BPA на протяжении всей своей жизни. Наша методология была разработана для изучения малых доз облучения BPA в раннем эмбриогенезе, с целью анализа ее воздействия на жизнеспособность эмбриона и тонкие долгосрочного воздействия на выживших. Насколько нам известно не методология была разработана для предоставления ранней стадии эмбрионов в очень низких дозах BPA, ограничиваясь определенного периода времени; Таким образом что делает метод представлен здесь роман.
Кроме того протоколы условии, здесь может быть легко адаптирована для изучения последствий других ЭЭС на этапе распространения эмбриогенеза. Однако с целью изучения конце эмбриональных стадий, Протокола потребует ключевые изменения в критическое время окно развития под фокус. Кроме того наш протокол не будут пригодны для экспериментов, требующих времени экспозиции токсиканта, как он открывает возможность альтернативного развития пути, что приводит к долгоживущих срок ареста на втором цикле линьки, который устойчив для суровых условий20. Дальнейшие корректировки и уточнения будут необходимы для длительного воздействия раз через дополнение с источником питания, который не имеет потенциал к метаболизму токсикант или EDC например газобетона E. coli. В заключение, наша методология может использоваться для оценки воздействия различных эндокринных, нарушая химических веществ на плодовитость и нейрональных функции в системе беспозвоночных модель C. elegans.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддержка NSF (EPSCoR EPS-0814251) и благодарностью NIH (1P20GM103653-01A1) MKT и HSD, поддержка институциональных студентов Делавэр государственного университета в МДМ (название III HBGI) и KRS (низ-INBRE). Благодаря C. elegans генетического центра (при поддержке Канцелярии NIH исследовательской инфраструктуры программы P40 OD010110) C. elegans одичал тип N2 штамма.
Materials
| NaCl | Fisher | 7647-14-5 | |
| Peptone | Fisher | S25761B | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| MgSO4 | Fisher | 7487-88-9 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| KH2PO4 | Fisher | P286-1 | |
| K2HPO4 | Fisher | 7758-11–4 | |
| KOH | Fisher | 1310-58-3 | |
| Bleach | Clorox | n/a | |
| Na2HPO4 | Fisher | BP332-500 | |
| LB | Fisher | BP1426-500 | |
| BPA | Sigma-Aldrich | 239658-250g | |
| BPS | Sigma-Aldrich | 103039-100g | |
| EtOH | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| E.coli OP50 | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| N2 (Wild-type C. elegans) worms | CGC | Repository at U of Minnesota | |
| Platinum wire pick | Genesee Scientific | 59-AWP | |
| Petri plates | Fisher | 07-202-011 | |
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TYY |
Referenzen
- Gore, A. C., et al. Executive Summary to EDC-2: The Endocrine Society’s Second Scientific Statement on Endocrine-Disrupting Chemicals. Endocr. Rev. 36, 593-602 (2015).
- Braun, J. M. Early-life exposure to EDCs: role in childhood obesity and neurodevelopment. Nat. Rev. Endocrinol. 13, 161-173 (2017).
- Melnik, R., et al. Summary of the National Toxicology Program’s Report of the Endocrine Disruptors Low-Dose Peer Review. Environ. Health Perspect. 110, 427-431 (2002).
- Kortenkamp, A. Ten years of mixing cocktails: a review of combination effects of endocrine-disrupting chemicals. Environ. Health Perspect. 115 Suppl 1, 98-105 (2007).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocr. Rev. 33, 378-455 (2012).
- Eramo, S., Urbani, G., Sfasciotti, G. L., Brugnoletti, O., Bossu, M., Polimeni, A. Estrogenicity of bisphenol A released from sealants and composites: a review of the literature. Ann Stomatol. (Roma). 1, 14-21 (2010).
- Cantonwine, D. E., Ferguson, K. K., Mukherjee, B., McElrath, T. F., Meeker, J. D. Urinary Bisphenol A Levels during Pregnancy and Risk of Preterm Birth. Environ. Health Perspect. 123, 895-901 (2015).
- Vandenberg, L. N., Maffini, M. V., Sonnenschein, C., Rubin, B. S., Soto, A. M. Bisphenol-A and the great divide: a review of controversies in the field of endocrine disruption. Endocr. Rev. 30, 75-95 (2009).
- Suzuki, T., et al. Prenatal and neonatal exposure to bisphenol-a enhances the central dopamine d1 receptor-mediated action in mice: enhancement of the methamphetamine-induced abuse state. Neurowissenschaften. 117, 639-644 (2003).
- Rosenfeld, C. S. Bisphenol A and phthalate endocrine disruption of parental and social behaviors. Front. Neurosci. 9, 1-15 (2015).
- Patisaul, H. B., Adewale, H. B. Long-term effects of environmental endocrine disruptors on reproductive physiology and behavior. Front. Behav. Neurosci. 3, 10 (2009).
- Lee, D., Jacobs, D. R. Methodological issues in human studies of endocrine disrupting chemicals. Rev. Endocr. Metab. Disord. 16, 289-297 (2015).
- Mimoto, A., et al. Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans. Biochem. Biophys. Res. Commun. 364, 883-888 (2007).
- Allard, P., Colaiacovo, M. Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germline and causes chromosome abnormalities. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 20405-20410 (2010).
- Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults. Behav. Brain. Funct. 11, 27 (2015).
- Chen, Y., et al. Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of Germline Function. PLoS Genet. 12, e1006223 (2016).
- Rankin, C. H., et al. Habituation revisited: an updated and revised description of the behavioral characteristics of habituation. Neurobiol. Learn. Mem. 92, 135-138 (2009).
- Hope, I. . C elegans: A Practical Approach. , (1999).
- Sanchez, K., Mersha, M., Dhillon, H. S., Temburni, M. Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays. J. Vis. Exp. , (2017).
- Hu, P. J. . WormBook The C. elegans Research Community. , (2007).
