낮은 복용량 유독 배아 노출의 장기 행동 및 생식 결과

프로토콜 아래에 주어진 초기 embryogenesis 동안 BPA 노출의 효과 테스트를 표준화 하 고 BPS, BPF 또는 다른 EDCs 및 선 충 C. 태아에 유독 사용 하기 위해 수정할 수 있습니다. 1. 소재 설정 NaCl의 1.5 g, 펩의 1.25 g 및 물 500 mL에 한 천의 8.5 g을 용 해 하 여 선 충 류 성장 미디어 (NGM)18 미디어의 500 mL를 준비 합니다. 압력가 마로 소독 (121 ° C, 15 PSI, 20 분), 후 추가 (5 mg/mL에 에탄올), 콜레스테롤의 0.5 mL 0.5 mL 1 M MgSO4, 0.5 mL 1 M CaCl2 와 12.5 mL 1 M 칼륨 인산 염 버퍼, pH 7.4 (108.3 g KH2포4 의의 의 K2HPO4, 물 1 L에 35.6 g). 1 N 코의 25 mL, 표 백제, 4 mL 및 물 71 mL를 혼합 하 여 차 아 염소 산 솔루션을 준비 합니다. 신선한이 솔루션을 확인 합니다. M9 버퍼 KH2포4의 3 세대, 나2HPO46 g, NaCl의 5 g, MgSO4, 및 1 나 물 1 M의 5 mL를 혼합 하 여 준비 0.02 M K2HPO4의 129 mL, KH2포4, 871 mL와 NaCl의 5.85 g을 혼합 하 여18 S 버퍼 준비 합니다. 압력가 마로 소독 하 여 M9 및 S 버퍼를 소독. 대장균 (스트레인 OP 50) 20 mL Luria 국물 (파운드)의에서의 숙박 문화를 성장. 1 m m 재고 솔루션 10% 에탄올에 BPA를 분해. S 버퍼에서 0.1 µ M, 0.5 µ M, 1 µ M, 5 µ M 및 10 µ M의 후속 희석을 확인 합니다.참고: 수성 S 버퍼에 희석 크게; 에탄올의 농도 감소 예를 들어,이 프로토콜 (10 µ M)에 설명 된 가장 높은 BPA 농도에서 에탄올의 농도 0.1 %v / v입니다. 2. 선 충 C. Culturing 및 동기화 NGM 미디어 100 mm 접시 (약 25 mL/접시)에 부 어 하 고 공고히 하 있습니다. 경화, 일단 하룻밤 성장 액체 문화에서 대장균 OP50의 150 µ L를 확산 하 여 판 씨. 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. 다음 날, 새로운 접시에 N2 웜 전송 청크 1 cm 광장의 대략적인 슬 래 브. 벌레 접시 보이는 배아를 포함 하는 잘 먹이 성숙한 어른으로 채워집니다 때까지 20 ° C에서 3 일 동안 성장 하는 것을 허용 한다. 동기화 할 각 접시 접시에 걸쳐 M9 버퍼의 최대 5 mL를 pipetting으로 세척. 살 균 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브에 액체를 전송.참고: 동기화 성인 벌레를 죽 일 하 여 상대적으로 같은 무대는 배아를 수집 이루어집니다. 어른 벌레의 느슨한 펠 렛을 얻기 위해 상 온에서 4 분 동안 3000 x g에서 원심. 10 mL 피 펫을 사용 하는 펠 릿을 그대로 있도록 상쾌한 조심 스럽게 제거. 차 아 염소 산 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 4 분 동안 실 온에서 3000 x g 에서 원심. 10 mL 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 M9 버퍼의 7 mL로 씻어. 이 단계를 두 번 반복 합니다. 3. 웜 BPA에 노출 위의 단계 2.7에서에서 마지막 세척 후 M9 버퍼와 계란의 약 100 µ L를 일시 중단 합니다. 이미 BPA S 버퍼에 희석 하는 적절 한 농도 포함 하는 2 mL microfuge 관에 계란의 약 50 µ L를 전송 합니다. S-버퍼 튜브 당 BPA (0.0 µ M, 0.1 µ M, 0.5 µ M, 1.0 µ M, 5.0 µ M 및 10 µ M)의 올바른 최종 농도 위해의 양을 조정 합니다. 표 1에서는 이러한 희석 수 있도록 한 가지 방법은 보여 줍니다. 최종 BPA 농도 대 한 BPA를 재고 (100 μ M) S 버퍼 동기화 된 웜 0.1 Μ M 1 Μ 949 Μ 50 Μ 0.5 Μ M 5 Μ 945 Μ 50 Μ 1 Μ M 10 Μ 940 Μ 50 Μ 5 Μ M 50 Μ 900 Μ 50 Μ 10 Μ M 100 Μ 850 Μ 50 Μ 표 1: 주식 BPA, S 버퍼 및 우리의 연구에 대 한 사용 원하는 농도 달성 하는 데 사용 하는 동기화 된 웜 통에 튜브를 배치 하 고 부드럽게 회전 통에 대 한 25 rpm 또는 락 통에 대 한 25 젖 힌 채/min에서 20 ° C에서 4 h 흔들. 4 h 후 튜브 튜브 홀더에 놓고 벌레 정착을 허용 합니다. 상쾌한 무시 하 고 시드 판 (NGM 접시 OP50 대장균) 벌레를 전송. 1.5에서 제시 된 대로 액체 OP50 대장균 문화를 만들고 판 2.1에 명시 된 씨앗. 20 ° C에 60 h에 대 한 성장 하는 벌레를 하자 매일 오염에 대 한 번호판을 검사 합니다. 오염된 NGM 접시는 보통 변색 하 고 개별 식민지와 함께. 과 밀에 대 한 현미경 벌레를 확인 합니다. OP50 대장균 잔디 및 작은 반점에 집중된 벌레의 부족과 밀을 의미 합니다. 4. 앞쪽 터치 Habituation 분석 결과 약 10 동기화 된 젊은 성인 벌레 화재 소독 30 G 플래티넘 와이어를 사용 하 여 새로운 unseeded NGM 접시를 받아 전송 합니다. 벌레를 있도록 5 분 동안 그대로 두고 새로운 접시에 순응 하는 시간. Habituation 응답 나무 꼬치 또는 이쑤시개의 끝에 연결 된 눈 썹 머리를 사용 하 고 70% 에탄올에 담그고, 소독 합니다. 깨끗 하 고 보풀 휴지로 닦 고 떨어져 증발 하는 에탄올에 대 일 분 동안 대기. 부드럽게 터치 (pharyngeal 전구의 앞쪽) 머리에 벌레 눈 썹 머리를 사용 하 여. 10 허용 접촉을 반복 벌레 복구를 할 수 있도록 접촉 사이 s. 벌레는 더 이상 뒤로 이동 될 때까지 (10 s interstimulus 간격 허용) 터치를 계속 합니다. 이 시점에서, 벌레는 자극에 익혀 진다. 길 들을 벌레에 필요한 접촉의 번호를 기록 합니다. Tukey의 포스트 hoc 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 치료 및 치료 컨트롤의 의미 요법이 니 속도 차이 분석 합니다. 5. 웜 통치 분석 결과 백 금 선택을 사용 하 여 신선 하 고 시드 플레이트를 개별 L3 벌레를 전송 합니다. 그 하나의 벌레 접시 당 배치는 다는 것을 확인 하십시오.참고: L3 애벌레 단계 후 웜 L4 애벌레 단계와 성인으로 개발. 그들은 그들은 이미 카운트에서 놓친 것 이라고는 계란은 마련 하지는 보장 하면서 개별 동물의 전송을 위해 충분히 큰에 그들을 일찍 수확 하는 것이 편리 합니다. 모든 12-24 h 누워 계란의 수를 계산 합니다. 후 새로운 접시에 부모 웜 전송. 웜은 일반적으로 5 일 후 계란, 누워 중지 될 때까지 반복 20 ° c.에서 알을 품을 때참고: 평균, 야생 타입 웜 수 알 최대 300; 따라서과 밀 방지 매일 새로운 접시에 부모를 전송 합니다. Tukey의 포스트 hoc 테스트 뒤 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 치료 및 치료 컨트롤에 의해 계란의 평균 수의 차이 분석 합니다.