В естественных условиях Мониторинг суточного часов экспрессии генов в мыши Супрахиазмальное ядро с помощью флуоресценции Репортеры
Summary
Этот недавно разработанный на основе флуоресценции технология позволяет долгосрочный мониторинг транскрипцию генов суточного часов в Супрахиазмальное ядро (SCN) свободно перемещения мыши в режиме реального времени и с высоким временным разрешением.
Abstract
Этот метод сочетает в себе опосредованного волоконно-оптических флуоресценции записей с точной доставки рекомбинантных аденоассоциированный вирус на основе гена репортеров. Этот новый и простой в использовании в vivo флюоресценция системы мониторинга была разработана для записи transcriptional ритм часы гена, Cry1, в Супрахиазмальное ядро (SCN), свободно движущихся мышей. Чтобы сделать это, репортер флуоресценции транскрипции Cry1 был разработан и упакованы в аденоассоциированный вирус. Очищенных, концентрированных вирус был введен в ППП, следуют вставки оптического волокна, который затем был установлен на поверхности мозга мыши. Животные были возвращены их дома клетки и позволило послеоперационное восстановление 1-месячный период для обеспечения достаточной репортер выражение. Флуоресценции затем был записан в свободно перемещающихся мышей через в vivo система мониторинга, которая была построена в нашем заведении. В естественных условиях система записи 488 нм лазер был увязан с 1 × 4-splitter луча, разделить четыре лазерного возбуждения выходы равной силы света. Эта установка позволила нам запись из четырех животных одновременно. Каждый из сигналов испускаемого флуоресценции была собрана через трубу фотоэлектронный умножитель и сбор данных карты. В отличие от предыдущих биолюминесценции в естественных условиях технике суточного часов записи, этот флуоресценции в vivo система записи допускается запись выражения гена суточного часов во время свет цикла.
Introduction
В млекопитающих Супрахиазмальное ядро (SCN) регулирует суточный ритм всего тела для координации реагирования индивида на экзогенных экологических изменений (например, свет, температура, напряжение и т.д.)1. Основные компоненты часы состоят из Per1-3, Cry1-2, будильники Bmal1и играть центральную роль в регулировании суточного часов каждой ячейки. Каждая ячейка в ППП содержит transcriptional активатор, часы/BMAL1, который действует как гетеродимера побудить выражение % и ПЛАКАТЬ. PER / CRY комплекс затем угнетает функции часы/BMAL1 для формирования обратной транскрипции перевод, что занимает около 24 ч до полного2,3.
Предыдущие исследования на СКС главным образом использовали ex vivo SCN ломтик культуры метод4,5,6 , и, хотя этот подход предоставляет ценную информацию, ее ограничения препятствуют нашей способности получение данных относительно влияния других ядер головного мозга на СКС, а также воздействия внешних раздражителей (например, свет) на клетки, проживающих в этой критической области. В 2001 году Хитоси Окамура группы был первым для использования системы биолюминесценции в vivo экспрессии генов монитор суточного часов в ППП в свободно перемещающихся мышей7. Кен ити Хонма группы провел за последние несколько лет, развивая биолюминесценции в vivo система записи в SCN8,9,10. Вместе эти исследования предоставили исследователям возможность контролировать суточного часов в постоянной темноты или после светового импульса. Однако потому что биолюминесценция слишком тусклыми, чтобы обеспечить непрерывный мониторинг во время цикла свет/темно, в сочетании с тем фактом, что свет является преобладающим сигнал, необходимые для СКС опосредованной уноса суточного часы11, есть растущий спрос на разработки экспериментальных методов, которые преодолеть ограничения, связанные с записью биолюминесценции. Текущий отчет описывает флуоресценции балльной системе, которая была построена для мониторинга суточного часов ППП в естественных условиях в свободно перемещающихся мышей. Этот простой в использовании метод позволяет непрерывный мониторинг во время цикла свет/темно и позволяет для долгосрочного наблюдения транскрипцию генов суточного часов в ППП в режиме реального времени и с высоким временным разрешением.
Protocol
Representative Results
Discussion
В отличие от ex vivo методы, такие, как кусок культуры4,5, RT-PCR16и в situ гибридизация17, которые требуют убитых животных, в естественных условиях записи метод позволяет следователей для изучения экспрессии генов суточного …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим членов в Чжан лаборатории для обеспечения стимулирования обсуждений и членов в Чжань лаборатории для оказания технической помощи. Это исследование было поддержано грантов 31500860 (чтобы циркон) NSFC, 2012CB837700 (для E.E.Z. и циркон) 973 программы от M.O.S.T. Китая и финансирование от Пекина муниципального правительства. E.E.Z. было поддержано китайской «Программа набора глобальных молодежных экспертов».
Materials
| KOD Plus Neo | TOYOBO | KOD-401 | Reagent |
| pVENUS-N1 | addgene | #61854 | Plasmid |
| pcDNA3.3_d2eGFP | addgene | #26821 | Plasmid |
| pAAV-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA | addgene | #20297 | Plasmid |
| MluI | Thermo Scientific | FD0564 | Reagent |
| EcoRI | Thermo Scientific | FD0274 | Reagent |
| Gibson Assembly Mix | NEB | E2611s | Reagent |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Scientific | 12566014 | Reagent |
| Syringe Filter | EMD Millipore | SLHV033RS | 0.45 µm |
| HiTrap heparin columns | gelifesciences | 17-0406-01 | 1 mL |
| Amicon ultra-4 centrifugal filter | EMD Millipore | UFC810024 | 100,000 MWCO |
| Benzonase nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Reagent |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D5670 | Make fresh solution for each batch |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| pentobarbital | SigmaAldrich | #1507002 | Reagent |
| mouse stereotaxic apparatus | B&E TEKSYSTEMS LTD | #SR-5M/6M | Equipment |
| Hydrogen peroxide solution | SigmaAldrich | #216763 | Reagent |
| Optical Fiber | Thorlabs | FT200EMT | 0.39 NA, Ø200 µm |
| microsyringe pump | Nanoliter 2000 Injector, WPI | Equipment | |
| ceramic ferrule | Shanghai Fiblaser | 230 μm I.D., 2.5 mm O.D. | |
| Gene Observer | BiolinkOptics | Equipment |
Referenzen
- Welsh, D. K., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Suprachiasmatic nucleus: cell autonomy and network properties. Annual Review of Physiology. 72, 551-577 (2010).
- Zhang, E. E., Kay, S. A. Clocks not winding down: unravelling circadian networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 764-776 (2010).
- Takahashi, J. S. Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock. Nature Reviews Genetics. 18, 164-179 (2017).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101, 5339-5346 (2004).
- Davidson, A. J., Castanon-Cervantes, O., Leise, T. L., Molyneux, P. C., Harrington, M. E. Visualizing jet lag in the mouse suprachiasmatic nucleus and peripheral circadian timing system. European Journal of Neuroscience. 29, 171-180 (2009).
- Savelyev, S. A., Larsson, K. C., Johansson, A. S., Lundkvist, G. B. Slice preparation, organotypic tissue culturing and luciferase recording of clock gene activity in the suprachiasmatic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).
- Yamaguchi, S., et al. Gene expression: View of a mouse clock gene ticking. Nature. 409, 684-684 (2001).
- Ono, D., Honma, K. I., Honma, S. Circadian and ultradian rhythms of clock gene expression in the suprachiasmatic nucleus of freely moving mice. Science Reports. 5, 12310 (2015).
- Ono, D., Honma, S., Honma, K. Circadian PER2::LUC rhythms in the olfactory bulb of freely moving mice depend on the suprachiasmatic nucleus but not on behaviour rhythms. European Journal of Neuroscience. 42, 3128-3137 (2015).
- Ono, D., et al. Dissociation of Per1 and Bmal1 circadian rhythms in the suprachiasmatic nucleus in parallel with behavioral outputs. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 114, E3699-E3708 (2017).
- Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418, 935-941 (2002).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genetics. 4, e1000023 (2008).
- Maywood, E. S., et al. Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110, 9547-9552 (2013).
- Ukai-Tadenuma, M., et al. Delay in feedback repression by cryptochrome 1 is required for circadian clock function. Cell. 144, 268-281 (2011).
- McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors. Journal of Visualized Experiments. 57, e3348 (2011).
- Yamaguchi, Y., et al. Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag. Science. 342, 85-90 (2013).
- Nagano, M., et al. An abrupt shift in the day/night cycle causes desynchrony in the mammalian circadian center. Journal of Neuroscience. 23, 6141-6151 (2003).
- Golombek, D. A., Rosenstein, R. E. Physiology of Circadian Entrainment. Physiological Reviews. 90, 1063-1102 (2010).
- Mei, L., et al. Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).
