自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化
Summary
このプロトコルでは、ホストの生理学的な条件の下でカンジダ菌のバイオ フィルム形成を視覚化するカスタマイズ可能な自動化されたマイクロ流体デバイスの使用について説明します。
Abstract
カンジダは、院内敗血症症例の約 15% を引き起こす人間の最も一般的な真菌病原体です。C. albicansの主な病原性属性は、そのバイオ フィルム フォームする能力、生物と非生物の表面に細胞の構造化されたコミュニティです。C. albicansのバイオ フィルムは、粘膜層などのホスト組織とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの医療機器を形成できます。物理と化学の摂動に強く、種子に貯水池播種性感染症として機能することができますので、バイオ フィルムは重要な臨床的課題を提起します。各種の in vitroアッセイは、 C. albicansのバイオ フィルム形成、マイクロタイター プレート アッセイ、乾燥重量測定、セル実行可能性の試金、共焦点走査型レーザー顕微鏡などの研究に利用されています。これらの試金のすべては、特定の時点でのバイオ フィルム形成の評価、単一エンドポイント アッセイです。ここでは、層流条件下で自動マイクロ流体デバイスを用いた実時間でのバイオ フィルムの形成を研究するためのプロトコルについて述べる。このメソッドは、血管カテーテルにおいて直面する問題など、ホストのそれらを模倣するカスタマイズ可能な条件を使用して、時間をかけて開発するバイオ、バイオ フィルム形成の観測できます。このプロトコルは、遺伝的変異のバイオ フィルムの欠陥だけでなく、バイオ フィルムにおけるリアルタイム抗菌剤の抑制効果を評価するために使用できます。
Introduction
しかし、それはまた、日和見主義の病原体、表面的な重症真菌感染症1,2を引き起こすことができる、カンジダは人間の微生物叢の共生メンバーです。C. albicansの主な病原性の特徴は弾力性のあるフォームにその能力と薬剤耐性のバイオ フィルム細胞のコミュニティ、表面に付着、細胞外マトリックス材料1,3で囲まれます。C. albicansのバイオ フィルムの構造高度、種類の細胞のいくつかの層を含む (ラウンド出芽酵母フォームのセル、オーバル偽セル、および尿細管の菌糸細胞)4。C. albicansのバイオ フィルムの開発で始まる画面で、これらの細胞の増殖が続く (シーディングにバイオ フィルム)、表面に丸い酵母型細胞の付着と未熟なバイオ フィルムの成熟に構造化し、完全に形成されたバイオ フィルム細胞外マトリックス材料4によって囲まれます。成熟したバイオ フィルムは主に、バイオ4に安定したアーキテクチャを提供する密な相互接続ネットワークを形成する細長い菌糸細胞で構成されます。バイオ フィルムのライフ サイクルでは、出芽酵母細胞成熟したバイオ フィルムから分散ぐるぐる播種性感染症を引き起こすまたは他サイト4,5で新しいバイオ フィルムをシードに体の他の地域への旅行があります。C. アルビカンスは生物の表面、粘膜面など、ホスト組織全体とカテーテル、ペース メーカー、入れ歯、人工関節などの非生物的表面にバイオ フィルムを形成できます。バイオ フィルムの反抗的な性質上、根絶することは困難、唯一の効果的な治療戦略は、多くの場合感染したデバイス4の除去。つまり、臨床現場で観察されたと同様の条件下でのバイオ フィルム形成を調査することが重要。
いくつか重要な生体内で動物のモデルC. albicansバイオ フィルム形成6,7,8; を研究するために使用しかし、これらの研究は高価、時間のかかることができます、系統と同時にテストすることができます抗菌剤の数によって制限されます。培養バイオ フィルムの試金、その一方で、抗真菌化合物および突然変異系統の高速、高スループットの評価を可能にする、はるかに費用対効果と運ばれるバイオ フィルム アッセイより倫理的な動物のモデル9、 10、11,12,13,14。ここで我々 が開発し、カスタマイズ可能なマイクロ流体デバイス14,15を使用して層流の下で一時的にバイオ フィルム形成を観察するように最適化の in vitroアッセイについて述べる。アッセイは、初期接着性のステップ、細胞の増殖、成熟バイオ フィルム細胞分散などのバイオ フィルム形成の各段階の可視化が可能です。試金はまたバイオ フィルムの開発中の細胞形態変化を視覚化するのに役立ちます。
マイクロタイター プレート、バイオ フィルム アッセイ培養、高スループット中は、制御フローの条件を許可しないため通常利用されています。伝統的な層流セル系バイオ フィルム形成の制御の流れの条件の継続的な評価を可能にするが、設定し、ダイナミック レンジ コントロールおよびスループットが制限する傾向があるに時間がかかることが多い。活用するマイクロ流体デバイス組み込み流室高スループット プレート (48 井戸を含む) を組み合わせることによりこれら制限を克服、高再現性、汎用性とカスタマイズ可能です。
ここでは、野生型C. albicansのバイオ フィルム形成を評価するために市販の自動マイクロ流体デバイスを使用するためのプロトコルについて述べるひずみ、バイオ フィルム、およびバイオ フィルムの発育に及ぼす知られている抗真菌剤バイオ フィルムを持っている以前報告された変異株 (bcr1Δ/Δ ・ Δ/Δ efg1 ) が 2 つの層の欠陥の in vitroとin vivoの16,17,18。記述のプロトコルは、バイオ フィルムのバイオ フィルム形成を阻害することで抗菌薬の有効性をテストするのには、ライブラリの突然変異体をスクリーニングによって通常バイオ フィルム開発に必要な遺伝子を識別するために使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明したカスタマイズ可能なマイクロ流体バイオ フィルム アッセイでのバイオ フィルム形成の可視化は、固定レート層流および一定した温度に露出されたときに単一セルのレベルでリアルタイム。野生型および変異株のバイオ フィルムの研究開発に強力な手段を提供しています, 生理学的条件を模倣条件下でバイオ フィルムに対する抗菌剤治療の効果臨床設定で.異なり、ほとんど<e…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は、バイオ フィルムの試金の役に立つ議論のノビレ ラボのすべてのメンバーを感謝します。この調査は、健康 (NIH) のグラント R21 AI125801 (C.J.N.) に国立衛生研究所によってサポートされました。地下鉄は、メキシコとアメリカ合衆国 (UC mexus フライ) と国立ナシオナル デ サイエンス y Technologia (CONACYT) カリフォルニア大学の大学から博士課程フェローシップによって支えられました。
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Referenzen
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
