昆虫細胞 (sf9) 蛋白質機能の試金のための外国遺伝子の一過性発現
Summary
このプロトコルを記述する外国蛋白質を表現するまたは潜在的な外国蛋白質とその切り捨てられたのアミノ酸の抗アポトーシス活性を評価に使用することができます熱衝撃によるタンパク質発現システム (pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システム)昆虫細胞での酸。
Abstract
一過的遺伝子発現系は、細胞培養システム培養バキュロ ウイルスのタンパク質機能解析を実行するための最も重要な技術の一つです。このシステムは、エクスプレス遺伝子一過性発現プラスミドの baculoviral プロモーターの制御下に開発されました。さらに、このシステムは、バキュロ ウイルス自体または外国蛋白質の機能アッセイに適用できます。最も広く、商業的に利用可能な一過的遺伝子発現系は、ヒメシロモンドクガ pseudotsugata multicapsid 核 (OpMNPV) の即時初期遺伝子 (IE) プロモーターに基づいて開発です。ただし、昆虫細胞における外来性遺伝子の低い発現レベルが認められました。したがって、一過的遺伝子発現系が蛋白質の表現を改善するため建設されました。このシステムは、組換えのプラスミッドはショウジョウバエ熱ショック 70 (Dhsp70) プロモーターの制御の下でターゲット シーケンスを格納する建設されました。このプロトコルはこの熱ショック ベース pDHsp/V5 渓 (6 ヒスチジンと V5 epitope) のアプリケーションを提示/ハスモンヨトウ frugiperdaセル (sf9 細胞) システム;このシステムも候補タンパク質を昆虫細胞での抗アポトーシス活性を評価するための遺伝子発現だけでなく、利用可能なです。さらに、このシステムは、組換えプラスミドの 1 つをどちらか導入することができます。 または昆虫細胞の 2 つの潜在的機能的拮抗組換えのプラスミッドを co transfected。プロトコルはこのシステムの効率性を示しますこのテクニックの実践事例を提供しています。
Introduction
2 つの蛋白質の表現システムは、タンパク質を生成するためよく使用されている: 原核生物の蛋白質の表現システム (大腸菌発現系) と真核生物の蛋白質の表現システム。1 つの人気のある真核生物のタンパク質発現系は、バキュロ ウイルス発現ベクター システム (BEVS)1です。バキュロ最初農業の世界の生物的制御因子として使用された森林害虫と。最後の数十年で、バキュロ蛋白質発現ベクターと同様にバイオ テクノロジーのツールとして開発されました。バキュロのゲノムは二本鎖の環状 DNA とエンベロープのヌクレオカプシド2から成っています。までに、七十八バキュロ ウイルスより分離シーケンス3をされています。宿主昆虫細胞における baculoviral 遺伝子発現の時空間のカスケードを基に、遺伝子の転写が即時初期遅延初期、後期、および非常に遅い遺伝子4を含む 4 つの一時的なカスケードに分類できた。
BEVSs は、非常に遅い遺伝子プロモーター (すなわち、多面体または p10 プロモーター) ドライブ ターゲット遺伝子の組換えバキュロ ウイルスの相同組換えによって生成されたときに使用されたので、示されました。組換えバキュロ ウイルス昆虫細胞の異種蛋白の発現は哺乳類 (糖タンパク質生産に適しています) ポスト翻訳の修正蛋白質のそれに似ています。したがって、バキュロは広く使用されている5,6,7をされています。ただし、制限が 1 つ異なる昆虫細胞7N グリコシル化反応経路の存在であります。
したがって、新しいバキュロ ウイルス発現系、一過的遺伝子発現系が開発されました。このシステムは、昆虫細胞での baculoviral 即時初期プロモーター (すなわち 1プロモーター) のドライブの下で外来遺伝子を表現します。このシステムを使用して、ターゲット蛋白質すぐに表現できますすなわち 1プロモーターの制御下で良い N 型糖鎖7昆虫細胞で N グリコシル化反応経路を変更中。また、baculoviral 即時初期遺伝子は宿主細胞の RNA ポリメラーゼ II による転写は、活性化4の任意のウイルスの要因を必要としません。そのため、短い時間内の昆虫細胞で外国蛋白質を表現できます。までに、非定常遺伝子発現システムは細胞培養システム培養バキュロ ウイルスの蛋白質機能の試金を実行するための最も重要な技術の一つです。システムは、バキュロ ウイルスまたは外国蛋白質の機能を解析に適用できます。市販の一過的遺伝子発現系の 1 つは、ヒメシロモンドクガ pseudotsugata multicapsid 核 (OpMNPV) (OpIE2 と OpIE1 プロモーター) の即時初期遺伝子 (IE) プロモーターに基づいています。
ただし、昆虫細胞における外来性遺伝子の低い発現レベル頃まだ問題オピー プロモーターを用いた一過的遺伝子発現系に使用される8,9,10。したがって、別の一過的遺伝子発現系では、ショウジョウバエ熱衝撃蛋白質 70 (hsp70) 遺伝子8,9のプロモーターに基づいてを構築されました。Hsp70 のプロモーターは IE baculoviral プロモーター昆虫細胞10熱ショックによる場合よりも効率的に動作します。このシステムでターゲット遺伝子はショウジョウバエ熱ショック 70 (Dhsp70) プロモーターのドライブの下で表現されました。外来遺伝子を PCR クローニング法による一過的遺伝子発現プラスミドに簡単に複製することができます。さらに、熱衝撃誘導による遺伝子発現のタイミングの制御を実行できます。
本報告では、我々 のアプローチに従うし、熱ショックによる一時的なタンパク質発現系を用いた baculoviral 遺伝子 (3 アポトーシスの阻害剤強 xylina MNPV からiap3 ) の 3 つの異なる切り捨てを表現し、さらに抗アポトーシス活性の解析にこれらの表現された蛋白質を適用します。このシステムは外国蛋白質を即座に表現することができますいずれかまたは他のタンパク質の活性測定法に適用する可能性もしながら sf9 細胞におけるタンパク質抗アポトーシス活性の評価に適用可能します。
Protocol
Representative Results
Discussion
熱ショックを利用した pDHsp/V5-彼/sf9 細胞システムの概念は、最初 1994年8クレムらによって記述されていた。Baculoviral 遺伝子プロモーター (IE1) とショウジョウバエ hsp70の比較を示したそのhsp70蚊細胞10でより高い効率を持っていた。さらに、正確に熱ショック処理後、熱ショック誘導によるタンパク質発現のタイミングを制御でき?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士建宏ルー 3 プラスミドの構造を提供する国立台湾海洋大学海洋生物研究所に感謝いたします。この研究によってグラント 106-2311-B-197-001 – 科学省から技術 (ほとんど) に対応しました。
Materials
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Gibco | 15240-062 | for insect cell culture |
| Certified Foetal Bovine Serum | Bioind | 04-001-1A | |
| Sf-900 II SFM | Thermo Fisher | 10902096 | serum-free cell culture medium |
| Sf9 cells | ATCC | CRL-1711 | |
| 25cm2 cell culture flask | Nunc, Thermo Fisher | 156340 | |
| Inverted light microscopy | WHITED | WHITED WI-400 | |
| RBC HIT Competent Cell | Bioman | RH618-J80 | Escherichia coli (DH5α) |
| L.B. Broth (Miller) | Bioman | LBL407 | |
| Agar, Bacteriological Grade | Bioman | AGR001 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | selection antibiotic |
| PCR Master Mix (2X) | ThermoFisher | K0171 | |
| Geneaid Midi Plasmid Kit (Endotoxin Free) | Geneaid | PIE25 | |
| Actinomycin D | SIGMA | A9415 | |
| Corning 50 mL centrifuge tubes | SIGMA | CLS430829-500EA | 50 mL tubes |
| Hemocytometer | Gizmo Supply Co | B-CNT-SLDE-V2 | |
| 24-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 142475 | 24-well plate |
| Cellfectin II Reagent | Thermo Fisher | 10362100 | cell transfectin reagent |
| PBS-Phosphate-Buffered Saline (10X) pH 7.4 | Thermo Fisher | AM9624 | |
| 4×SDS Loading Dye | Bioman | P1001 | |
| Immobilon-P (PVDF Blotting Membranes) | Merck Milipore | IPVH00010 | PVDF membranes |
| Mini Trans-Blot Cell system | BIO-RED | 1703930 | Blotting device |
| Ponceau S solution | SIGMA | 6226-79-5 | |
| Anti-V5 | SIGMA | V8137 | rabbit anti-V5 antibody |
| Goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase (HRP) | Jackson | 111-035-003 | |
| Tween 20 | Merck | 817072 | |
| 6-Well Multidish | Nunc, Thermo Fisher | 145380 | |
| 0.4 % trypan blue solution | AMRESCO | K940-100ML | |
| P10 pipetman | Gilson | F144802 | |
| P1000 pipetman | Gilson | F123602 | |
| Tape | Symbio | PPS7 | 24 well tape ( 19 mm×36 M) |
Referenzen
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