SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

PD は、主に高齢者¹モーター システムの機能不全の結果、中脳のドーパミン作動性ニューロンに影響最も一般的な神経変性疾患の一つです。ほとんどの患者は、PD を作成し散発的な方法で、病気を継承する家族が集まっています。FPD²とリンクするいくつかの遺伝子の突然変異が見つかっています。FPD の原因遺伝子の 1 つは、LRRK2、パーク 8 と呼ばれる支配的継承された FPD にリンク 8 のミスセンス変異 (N1437H、R1441C、G、H、S、Y1699C、G2019S、および I2020T) にされているの報告された^3,4,5これまでのところです。いくつかのゲノムワイド関連研究 (GWAS) 散発的な PD 患者は PD、LRRK2 の機能に異常が散発的の両方の神経変性疾患の一般的な原因であることを示唆しているのリスク要因として LRRK2 軌跡におけるゲノム変化も確認します。パーク 8 FPD^6,7,8。

LRRK2 は、ロイシン豊富な繰り返しドメイン、複雑なタンパク質 (中華民国) ドメイン、ROC (COR) ドメイン、セリン/スレオニン蛋白質キナーゼ ドメインおよび⁹WD40 リピート ドメインの C 末端の GTP 結合 Ras から成る大規模な蛋白質 (2,527 アミノ酸) であります。8 つの FPD 変異をこれらの機能ドメインの検索します。N1437H と ROC ドメイン、COR ドメイン、G2019S とキナーゼ ドメインで I2020T で Y1699C で R1441C/G/H/S。それは、仮定される G2019S 突然変異は、PD 患者^10、11,12の突然変異を見つけた最も頻繁には、体外で2-3 倍¹³LRRK2 のキナーゼ活性が増加、のでLRRK2 substrate(s) のリン酸化の異常な増加は神経細胞に有毒であります。ただし、それされています患者派生サンプルで評価方法の不足のため散発的/家族性 PD 患者における生理学的関連 LRRK2 基板のリン酸化が変更されるかどうかを検討することが可能。

蛋白質のリン酸化は免疫ブロットまたは質量分析によるタンパク質のリン酸化状態を具体的に認識する抗体を用いた酵素抗体法 (ELISA) によって一般に検出されます。ただし、元の戦略時適用できませんリン酸化特異的抗体を作成する難しさのため。放射性隣酸塩に細胞の代謝ラベリングはリン酸化特異的抗体が容易に利用可能でない場合、リン酸化の生理的レベルを確認する別のオプションです。ただし、放射性物質の大規模な量を要求され、したがって放射線防護¹⁴のために特殊な機器を伴います。質量分析はより敏感なこれらの免疫化学的方法と比較して、蛋白質のリン酸化の分析に人気となったです。サンプル準備は時間がかかるし、高価な楽器が分析に必要です。

Rab10 Rab8 など Rab GTPase の家族のサブセットは、LRRK2 の直接生理学的な基板が¹⁵大規模プロテオーム解析の結果に基づき、最近報告されました。[Rab10 リン酸化された FPD 変異マウス胚性線維芽細胞、マウス¹⁶をノックの肺によって増加するデモンストレーションを行った。本報告では、ナトリウム dodecyl 硫酸塩ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を採用しました-P タグ分子が SDS ページのゲル (P タグ SDS-PAGE) Rab10 リン酸化の内因性のレベルを検出するために共重合する手法リン酸化 Rab10 の高感度抗体はまだ欠けていた。我々 は合計 Rab8 の現在入手可能な抗体の選択度が低くによる内因性 Rab8 のリン酸化を検出する失敗します。したがって、我々 は Rab10 リン酸化に焦点を当てることを決めた。LRRK2 は、Thr73 の非常に節約された「スイッチ II」地域の中で場所に行く Rab10 を廃止します。Rab 蛋白質リン酸化のサイトの高い保護は明確な Rab 蛋白質を認識する検体抗体が作りにくい理由の一つかもしれません。

LRRK2 による Rab8A のリン酸化は、Rabin8、GTP¹⁵にバインドされた GDP を交換することによって Rab8A をアクティブにグアニン ヌクレオチド交換因子 (GEF) の結合を阻害します。Rab10、LRRK2 による Rab8A のリン酸化は、Rab タンパク質の活性化に不可欠な膜¹⁵から GDP 結合 Rab 蛋白質の抽出は、GDP 解離阻害剤 (GDIs) の結合を阻害します。総称して、それは、LRRK2 による Rab タンパク質のリン酸化を防ぎます活性化正確な分子機構とリン酸化の生理的影響は明白でなく残るが、仮定されます。

P タグ SDS ページは 2006 年に木下らによって発明された: この方法ではアクリルアミドは P タグと共有結合は、SDS-PAGE に共高親和とリン酸塩を取り込み分子ゲル¹⁷。SDS ページのゲルの P タグ分子選択的リン酸化タンパク質の電気泳動移動度を遅らせる、ので P タグ SDS-PAGE は非リン酸化のものからリン酸化タンパク質を区切ることができます (図 1)。興味の蛋白質は複数の残基のリン酸化、リン酸化特異的形態に対応するバンドのはしごは見られなくなります。Rab10、場合 Rab10 で Thr73 だけでリン酸化されることを示す 1 つだけ移されたバンドを観察します。リン酸化特異的抗体と免疫ブロット上 P タグ SDS ページの主な利点は非リン酸化特異抗体 (すなわち、認識合計 Rab10) とイムノブロット リン酸 Rab10 が認識されること膜に転送された後である一般により特定、機密、および利用可能な商業学術ソースから。SDS ページ P タグを使用してのもう一つの利点は、リン酸化特異的抗体と免疫ブロットすること放射性と細胞の代謝ラベリングによって不可能である 1 つは、リン酸化の化学量論の近似的評価を取得できることリン酸塩。

別に安価な P タグ アクリルアミドおよびそれに関連するいくつかのマイナーな変更の使用は、現在 LRRK2 による Rab10 リン酸化の検出法免疫ブロットの一般的なプロトコルに従います。したがって、免疫ブロットが浄化された蛋白質、セル lysates の組織乳剤などのサンプルの任意のタイプの通常の練習を任意の所で簡単であり、容易に実行可能ファイルをする必要がありますそれ。