Met behulp van fylogenetische analyse te onderzoeken van eukaryotische Gene oorsprong

DNA of RNA-sequenties dragen genetische informatie voor onderliggende fenotypen die kunnen worden geanalyseerd door middel van fysiologische en biochemische methoden of waargenomen door morfologische en fossiele bewijsmateriaal. In een zin is genetische informatie betrouwbaarder dan de evaluatie van externe fenotypen, omdat de eerstgenoemde de basis voor de laatste is. In de studie van het evolutionaire is fossiele bewijsmateriaal zeer direct en overtuigend. Veel organismen, zoals micro-organismen, hebben echter weinig kans om te vormen van een fossiele tijdens lange geologische leeftijden. Daarom, moleculaire informatie zoals nucleotidesequenties en aminozuur-sequenties van verwante extant organismen zijn van waarde voor het verkennen van de evolutionaire relaties¹. In de huidige studie, was een eenvoudige inleiding van fylogenetische basiskennis en een easy-to-learn protocol voorzien door nieuwkomers die moeten opbouwen van een fylogenetische boom op hun eigen.

Zowel DNA (nucleotide) en eiwit (aminozuur) sequenties kunnen afleiden van de fylogenetische relaties tussen homologe genen, organellen of zelfs organismen²worden gebruikt. DNA-sequenties zijn meer kans om te worden beïnvloed door veranderingen tijdens de evolutie. Aminozuur sequenties zijn daarentegen veel stabieler, gezien het feit dat synoniem mutaties in nucleotidesequenties geen mutaties in aminozuur sequenties veroorzaken. Dientengevolge, zijn DNA-sequenties nuttig voor vergelijking van homologe genen van nauw verwante organismen, terwijl aminozuur sequenties geschikt voor homologe genen van verte verwante organismen^{3 zijn}.

Een fylogenetische analyse begint met de uitlijning van aminozuur of nucleotide sequences⁴ ontvangen van een geannoteerde genoom sequencing database⁵ vermeld in FASTA formaat, dat wil zeggen, vermeende of uitgedrukt proteïne sequenties, RNA-sequenties , of DNA-sequenties. Het is vermeldenswaard dat het is van cruciaal belang voor het verzamelen van kwalitatief hoogwaardige sequenties voor de analyse, en alleen homologe reeksen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van verwantschappen. Veel verschillende platforms zoals Clustal W, Clustal X, spier, T-coffee, MAFFT, kan worden gebruikt voor de sequentie alignering. De meest gebruikte Clustal Omega^6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), die kunnen online worden gebruikt of kan gratis gedownload worden is kosteloos. De uitlijning tool heeft veel parameters die de gebruiker kan aanpassen voordat u de uitlijning, maar de standaardparameters werken goed in de meeste gevallen. Nadat het proces voltooid is, moeten de sequenties die zijn uitgelijnd worden opgeslagen in de juiste indeling voor de volgende stap. Ze moeten vervolgens worden bewerkt of ingekort met behulp van een software voor videobewerking, zoals BioEdit, omdat de fylogenetische boom constructie door MEGA vergt de sequenties van gelijke lengte (met inbegrip van zowel aminozuur afkortingen en afbreekstreepjes. In de gebonden reeks, elke positie zonder een aminozuur of nucleotide wordt vertegenwoordigd door een koppelteken “-“). In het algemeen, alle uitstekende aminozuren of nucleotiden aan weerszijden van de uitlijning moet worden verwijderd. Kolommen met slecht uitgelijnde sequenties in de uitlijning kunnen bovendien worden verwijderd omdat ze weinig waardevolle informatie overbrengen, en soms verwarrend of valse informatie³kunnen geven. Op dit moment of in de latere fase van de boom bouw, kunnen de kolommen met een of meer afbreekstreepjes worden verwijderd. Als alternatief, ze kunnen worden gebruikt voor fylogenetische berekening. Wanneer de sequentie alignering en trimmen is voltooid, moeten de sequenties die zijn uitgelijnd worden opgeslagen in FASTA, en het gewenste formaat, voor later gebruik.

Veel softwareplatformen bieden boom bouw functies met behulp van verschillende methoden of algoritmen. In het algemeen, kunnen de methoden worden geclassificeerd als afstand matrix methoden of discrete gegevens methoden. Afstand matrix methoden zijn eenvoudig en snel te berekenen, terwijl de afzonderlijke methoden zijn ingewikkeld en tijdrovend. Voor zeer nauw verwante taxa met een hoge mate van delen van aminozuur of nucleotide sequentie identiteit, een afstand matrix methode (Neighbor toetreden: NJ; Ongewogen paar methode met rekenkundig gemiddelde Group: UPGMA) van toepassing is; voor zijdelings verwante taxa, een discrete data, methode (Maximum Likelihood: ML; Maximale spaarzaamheid: MP; Bayesian gevolgtrekking) is optimale^3,8. In deze studie werden de ML-methoden van MEGA (6.0.6) en Bayesian gevolgtrekking (MrBayes 3.2) toegepast voor de bouw van de fylogenetische bomen⁹. Ideaal, wanneer het juiste model en de parameters worden gebruikt, de resultaten afgeleid van verschillende methoden kunnen worden consistent, en ze zijn dus betrouwbaarder en overtuigend.

Voor een ML fylogenetische boom gebouwd met behulp van MEGA¹⁰, moet het bestand van de gebonden reeks in FASTA indeling worden geüpload in het programma. De eerste stap is dan om te selecteren van het model van de optimale vervanging voor de geüploade gegevens. Alle beschikbare vervanging modellen worden vergeleken op basis van de geüploade sequenties, en hun definitieve scores worden getoond in een tabel van de resultaten. Selecteer het model met de kleinste Bayesian informatie criterium (BIC) score (als eerste vermeld in de tabel), ML parameters volgens de aanbevolen model instellen en beginnen met de berekening. De rekentijd varieert van enkele minuten tot enkele dagen, afhankelijk van de complexiteit van de geladen gegevens (lengte van de sequenties en aantal taxa) en de prestaties van de computer waarop de programma’s worden uitgevoerd. Wanneer de berekening is voltooid, wordt een fylogenetische boom getoond in een nieuw venster. Sla het bestand op als “FileName.mat”. Na het instellen van parameters om op te geven van het uiterlijk van de boom, sla nogmaals. Met deze methode, kunt MEGA genereren publicatie rang fylogenetische boom cijfers.

Voor de bouw van de boom met MrBayes¹¹is de eerste stap om de uitgelijnde reeks, die meestal is vermeld in FASTA formaat, transformeren naar nexus-indeling (.nex als het bestandstype). FASTA bestanden omzetten naar nexus-indeling kan worden verwerkt in de MEGA. De volgorde van de uitgelijnd in nexus formaat kan vervolgens worden geüpload in MrBayes. Wanneer het bestand is geüpload, geeft gedetailleerde parameters voor de berekening van de boom. Deze parameters omvatten gegevens zoals aminozuur vervanging model, variatie tarieven, ketting nummer voor Markov chain Monte Carlo (MCMC), koppeling, ngen nummer, gemiddelde standaardafwijking van frequenties van het split, enzovoort. Nadat deze parameters zijn opgegeven, start de berekening. Op het einde, wordt twee cijfers van de boom in de code van de ASC II, één weergegeven: clade geloofwaardigheid en de andere weergegeven: tak lengtes, getoond op het scherm.

Het resultaat van de boom zal automatisch worden opgeslagen als “FileName.nex.con”. Deze boom-bestand kan worden geopend en bewerkt door FigTree, en de figuur weergegeven in FigTree verder om het te maken meer geschikt voor publicatie kan worden gewijzigd.

In deze studie werden 228 zoete eiwitten, met inbegrip van 35 snoep van eencellige eukaryoten en 57 SemiSWEETs van prokaryoten, geanalyseerd als voorbeeld. Zowel de snoep en SemiSWEETs werden gekenmerkt als glucose, fructose of sacharose vervoerders over membranen^12,13. Fylogenetische analyse blijkt dat de twee MtN3/speeksel domeinen met snoep op een evolutionaire samensmelting van een bacteriële SemiSWEET en een archaeon¹⁴kunnen worden ontleend.