Rilevamento rapido dei fenotipi di Neurodevelopmental in cellule precursori neurali umane (NPC)

L’uso di organismi più semplici e modelli murini ha chiarito i meccanismi di sviluppo di base del cervello così come la patogenesi della malattia. Nonostante questi progressi, l’eziologia di molti disturbi neuropsichiatrici resta sfuggente, perché non tutti i risultati negli organismi più semplici sono direttamente rilevanti per aspetti complessi della malattia umana. Inoltre, la maggiore complessità del cervello umano spesso rende difficile lo sviluppo umano di modello e disturbi negli animali. Con l’evoluzione e il progresso della tecnologia (hiPSCs) le cellule staminali pluripotenti indotte umane, cellule somatiche può essere riprogrammate in cellule staminali e quindi differenziate in cellule di un neurone per studiare la malattia umana. Gli avanzamenti nelle tecnologie hiPSCs e “omiche” (genomica, trascrittomica, proteomica e metabolomica) promettono di rivoluzionare la comprensione dello sviluppo del cervello umano. Queste tecnologie rendono ora possibile un approccio di “precisione medicina” per la caratterizzazione della malattia neuropsichiatrica caso per caso.

La graffetta corrente nel campo di malattia-modellazione hiPSC è di differenziare le cellule in sottotipi neuronali specifici in un monostrato o a utilizzare un sistema di cultura 3D chiamato un organoid per ricapitolare gli aspetti del cervello sviluppo^{1,2, 3}. Questi sistemi sono stati incredibilmente preziosi nello studio e scoprire aspetti unici di sviluppo umano e malattia^4,5,6,7. Tuttavia, sia colture neuronali e organoids spesso richiedono ovunque da settimane a mesi nella cultura prima che siano pronti a studiare. La natura che richiede tempo di questi protocolli e la quantità di risorse necessarie per mantenere che questi sistemi di cultura spesso limitano il numero di esperimenti che possono essere effettuati e il numero di variabili (come fattori di crescita o farmaci) che possono essere testati. Inoltre, molti studi che utilizzano organoids e neuroni post-mitotici sono concentrati sui processi come la formazione di dendrite escrescenza o sinapsi, che si verificano più avanti nello sviluppo. Mentre questi processi sono stati implicati nella patologia di disturbi dello sviluppo come l’autismo e la schizofrenia, all’inizio dello sviluppo eventi che si verificano prima definitiva differenziazione neuronale sono anche importanti per la patogenesi della malattia^{8 ,9,10,11,12,13}. Infatti, recenti studi genomici mostrano che il periodo di metà-fetale, che è composto di proliferazione, conseguenza del processo e la migrazione, è particolarmente importante nell’autismo patogenesi^11,14. Pertanto, è importante studiare le staminali neurali e popolazioni di cellule progenitrici per comprendere meglio questi processi precedenti. Organoid sistemi, che sono lo sviluppo del cervello umano di riepilogo considerato al meglio a causa della loro natura 3D e la struttura organizzata, contengono un pool di cellule progenitrici che è stato utilizzato per studiare alcuni di questi eventi precedenti. Tuttavia, la popolazione di cellule progenitrici in organoids è spesso scarsa e più come cellule gliali radiali di neurali staminali o progenitrici cellule^5,15. Così, sarebbe utile avere un metodo di throughput elevato per studiare le prime fasi del neurosviluppo in una popolazione delle cellule attivamente proliferative.

In laboratorio, abbiamo creato un protocollo che utilizza le cellule precursori neurali hiPSC-derivato (NPC), una popolazione mista di progenitrici cellule staminali neurali e che è altamente proliferative, di studiare i processi neurodevelopmental quali la proliferazione, migrazione cellulare, e estensione del processo iniziale (neurite). Queste analisi sono state sviluppate da tecniche utilizzate nel nostro laboratorio per decenni per studiare con successo neurosviluppo nei ratti e topi culture corticali^{16,17,18,19,20, 21,22,23}. D’importanza, inoltre è stato indicato che fenotipi e segnali di regolazione definiti nei sistemi di coltura di ratti e topi sono altamente predittivi di meccanismi che sono attivi in vivo, che indica il valore di queste tecniche^{16, 17,18,19,24}. Dopo la differenziazione iniziale di hiPSCs di NPC, questi metodi ci permettono di studiare processi vitali dello sviluppo in pochi giorni. Questi metodi hanno molti vantaggi: (1) richiedono poco sofisticate apparecchiature e sono facili da implementare, (2) numerose repliche sperimentali possono essere condotti in un breve periodo di tempo, permettendo per conferma veloce della riproducibilità dei risultati e (3) variabili di cultura come matrici di rivestimento, gli effetti dei fattori di crescita e l’attività dei farmaci possono essere testate in modo rapido ed economico. Inoltre, approfittiamo del ruolo ormai consolidato di fattori di crescita extracellulari come regolatori critici di diversi processi di sviluppo. I PNG sono stati esposti per selezionare i segnali dello sviluppo che direttamente stimolano eventi come proliferazione, neuriti e migrazione cellulare e hanno trovato che migliorano la capacità di identificare i difetti che non sono evidenti in condizioni di controllo^{19 , 25 , 26 , 27 , 28}. allo stesso modo, la facilità di valutazione farmaci fornisce un potente viale per adottare tecniche di medicina di precisione per verificare l’efficacia dei vari interventi terapeutici. Così, questo protocollo facilita un throughput elevato, riproducibile e semplice metodologia per studiare lo sviluppo iniziale del cervello, patogenesi della malattia e gli effetti benefici potenziali di fattori di crescita e di droghe sui fenotipi neurodevelopmental.