Un en Vivo Dúo color método de proyección de imagen dinámica Vascular tras lesión medular contundente

Se realizaron todos los procedimientos de manejo quirúrgico y animal aprobado bajo la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio (National Research Council) y las directrices de la Indiana University School de medicina institucional Animal Care y el uso Comité. 1. quirúrgico preparación Esterilizar todas las herramientas quirúrgicas incluyendo el estabilizador de la columna vertebral. Limpiar la mesa y todos los alrededores con etanol al 70%. Para la preparación de la intervención quirúrgica no supervivencia, coloque una almohadilla de limpieza quirúrgica en la parte superior a 37 ° C cojín de calefacción. Rata de Sprague Dawley (SD) seis semana de edad de uso para este estudio. Pesan y anestesiar la rata con una inyección intraperitoneal de ketamina (87,7 mg/kg) y xilacina (12,3 mg/kg) de mezcla. Confirmar escenario adecuado de anestesia cuando el animal deja de responder a un estímulo del pellizco del dedo del pie. Inyectar por vía subcutánea 0.01-0.05 mg/kg de buprenorfina y 5mg/kg de carprofeno antes de la cirugía. Afeitarse la rata en 2 zonas: la región cervical de la espina dorsal en la espalda y la región del cuello en el lado de la mama. Limpiar las áreas de la piel con betadine lavado quirúrgico y toallitas de alcohol al 70%. Aplique el ungüento de ojo para evitar el ojo seco durante la cirugía. Coloque el animal en posición decúbito supina en la almohadilla de limpieza quirúrgica. 2. cateterización de la vena yugular externos Localizar la vena yugular externa por encontrar el punto de pulso cerca de la clavícula y corte con un par de tijeras pequeñas primavera para hacer una incisión vertical en el terreno, que es el punto de Cruz de 3 puntos anatómicos: caudal ramus de la mandíbula derecha, tubérculo mayor del húmero y manubrio (figura 1A). Aislar el vaso usando una primavera tijeras y pinzas finas. Atar el extremo distal con sutura quirúrgica estéril 1 línea (figura 1)20. Preparar una jeringa de 1 mL llena con suero fisiológico y conectar con un catéter especializado de una aguja de calibre 21 (figura 1B). Hacer una pequeña incisión con un micro tijeras en el buque y deslice el catéter dentro del vaso. Asegure la aguja atar tanto el extremo proximal y distal (figura 1). El catéter especializado se hace de una aguja de calibre 21. Rutina la punta plana y la soldadura con una pieza de 2 mm de la punta de cortan de otra aguja de calibre 21. Esto puede evitar que el catéter se fuera. Nota: Una pequeña cantidad de sangre que circula dentro de la aguja indica que la aguja ha entrado con éxito en un vaso sanguíneo. 3. estabilización columna vertebral y laminectomía C5-C7 Coloque el animal en una posición propensa. Cortar la piel a lo largo de la línea media con una hoja de bisturí Nº 15 en los niveles deseados de espinales. Disecar las capas musculares de la 5th a 7th vértebras cervicales (C5-C7) bilateralmente para exponer las facetas laterales (figura 2A)21. Nota: Ubicar la segunda vértebra torácica (T2) por encontrar el punto entre los omóplatos. Contar hacia arriba desde la vértebra T2 encontrar vértebra C721,22,23,24. Estabilizar la columna vertebral de la rata usando un aparato estabilizador modificado. Hacer un corte en ambos lados del hueso vertebral lateral. Deslice los brazos de acero inoxidable por debajo de las facetas del proceso transversal expuesta y apriete los tornillos para garantizar la estabilidad (figura 2B). Retire con cuidado las láminas de C5-C7 (laminectomía, figura 2). Coloque un pedazo pequeño de gelfoam empapado de solución salina en la parte superior la duramadre expuesta para mantenerla hidratada (Figura 2D). 4. instalación de dos fotones (2P) proyección de imagen de ventana Pequeños trozos de materia de gelfoam en el boquete entre los músculos y los huesos vertebrales, también una línea delgada de gelfoam entre médula espinal y los huesos vertebrales de la materia, entonces utilice pegamento adhesivo tejido para sellar la zona músculo-hueso. Esperar 5 min para la sequedad completa (Figura 2E). Nota: Este paso previene con eficacia el futuro sangrado dentro de la ventana y la filtración de soluciones de inmersión. Preparar el agar al 4% con ddH2O en el microondas. Después de que el agar se disuelva completamente, espere hasta que vuelva a una temperatura tangible. Llene una jeringa estéril de 1 mL con solución de agar y pipa en el borde de la ventana para construir una pared (Figura 2E). La solución se solidifica rápidamente y se mantiene flexible para permitir que la lente u objetivo se mueva libremente. Cuando esté listo para la proyección de imagen, eliminar el líquido de inmersión de gelfoam y lugar dentro de la ventana para 2P proyección de imagen (figura 2F). Transferir el animal estabilizado dentro de la cámara oscura de 2 fotones microscopio y colocar la ventana de proyección de imagen de 2P directamente debajo de la lente. Baje cuidadosamente la lente en la ventana de imagen. 5. la inyección del primer colorante fluorescente y proyección de imagen de línea de base Preparar 0,5 mL de RHODAMINA B isotiocianato-dextrano (peso molecular promedio de 4 mg/mL ~ 70kDa) en solución salina. Llene una jeringa estéril de 1 mL con la solución y conecte la jeringa al catéter previamente instalado. Nota: Preparar la solución colorante fluorescente antes de que se recomienda utilizar. Inyectar el tinte primero presionando la jeringa muy lentamente (figura 3B). En primer lugar, utilice el ocular para identificar el área de interés. Utilizar una cámara de carga dispositivo acoplado (CCD) para adquirir una imagen de campo claro de los patrones de vasos sanguíneos superficiales en baja magnificación como imagen de referencia. Cambiar al modo escaneo láser abrir el 2P imaging software para la recogida de ambas imágenes y datos de barrido de línea. Seleccione la correcta P 2 laser excitación longitud de onda, potencia y fluorescente canal (canal rojo para el primer tinte) para que coincida con los fluoróforos en el tejido de la imagen y luego realizar en vivo la proyección de imagen (figura 3E). Mantener al animal en una almohadilla de calefacción durante todo el proceso. 6. C7 lesión contundente con dispositivo de LISA Realizar una herida de contusión C7 línea media usando un dispositivo del aparato de sistema de lesiones de Louisville (LISA) según un protocolo previamente establecido25,26. En Resumen, coloque el animal en el escenario de LISA después de calibración.Después de seleccionar un ajuste de punto cero y ajuste de tejido desplazamiento 0,800 mm (en este caso), haga clic en el botón “Ejecutar experimento” del software que desencadenan la liberación de impactador y crear la lesión. Después de la lesión, coloque otro pedazo pequeño de gelfoam empapado de solución salina en la parte superior la duramadre expuesta para mantenerla hidratada. Repita el paso 4.3 y volver a realizar en vivo la proyección de imagen en la misma área visible con el colorante rojo previamente inyectado (figura 3 & F). Transferencia de la espalda del animal a la mesa quirúrgica y que el animal sedado con anestesia adecuada siguiendo el protocolo de IACUC íntimamente. 7. inyección de segundo colorante fluorescente y la proyección de imagen de la lesión 0,5 mL de fluoresceína isotiocianato-dextrano (4 mg/mL, peso molecular promedio ~ 70 kDa) se preparan en solución salina igual que en 5.1. Llene la solución en una jeringa estéril de 1 mL y conecte con el catéter previamente instalado. La espalda animal estabilizada dentro de la cámara oscura del microscopio 2P la transferencia y cambio de imagen la misma área con el canal rojo para el primer colorante y el canal verde para el segundo colorante (figuras 3D & G). Al final de la proyección de imagen, suelte la rata desde el dispositivo de estabilización espinal y limpiar la pared de agar. 8. animal sacrificio Después de la proyección de imagen, sacrificar la rata después de la perfusión de transcardial protocolo27. Recolectar las muestras de la médula espinal y fijarlos en el 4% PFA. 9. Análisis de datos offline: Cuantificación de diámetros de recipiente Transferir los archivos de imagen a una estación de trabajo para análisis fuera de línea. Abrir ImageJ y seleccione “archivo” y seleccione guardado previamente los datos en bruto y abra el archivo de imagen asociado (Figura 4B). Calibrar la imagen seleccionando “Analizar” seguido por “Set Scale” (figura 4). El valor en “La distancia en píxeles” es calculado utilizando la ecuación mostrada en la Figura 4A. La calibración de la lente óptica de 2 fotones determina el valor predeterminado en la ecuación. El valor de “opticalZoom” se encuentra en Excel Extensible Markup Languagefile (archivo XML) asociado con el archivo de imagen (Figura 4B). Trazar una línea perpendicular al eje longitudinal de la embarcación (figura 41 & E1) y seleccionar “Analizar” seguido por “Medida”. La medida del diámetro del vaso se muestra en la ventana de resultados (figura 42 & E2). Repita 3 veces en toda la nave para adquirir el valor medio. 10. línea análisis de datos: Cuantificación de glóbulos rojos (RBC) velocidad de la célula Transferir los archivos de barrido de línea a la estación de trabajo para el análisis. Inicie el software ImageJ y seleccione “archivo” y seleccione guardado previamente los datos en bruto y abrir todos los archivos asociados de barrido de línea con el nombre de extensión “.ome”. Abra “Imagen” y seleccione “Stacks” seguidos de “imágenes a la pila”. Convertir todos los archivos de OME en un archivo del TIFF imagen pila. Iniciar Matlab software y haga clic en “Abrir”, seleccione Archivo de código de “LSPIV_parallel.m”. Nota: El código de Matlab para LS-PIV se puede descargar en https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18 Seleccione las órdenes siguientes: “Ejecutar” > “Cambiar carpeta” > “arteria”. Elija el archivo del TIFF imagen pila generado en 10.3. Escriba “S” y presiona Enter. Poner un cursor a la izquierda y derecha de la imagen respectivamente, y el programa comienza a procesar los datos. Al final del programa, introducir 2 valores para calcular la lectura final: “valor de la conversión del pixel_meter” y “valor de conversión de tiempo de la exploración”. Ambos pueden encontrarse en el archivo XML asociado con datos de línea de exploración. El valor final se expresa como la media y desviación estándar de la velocidad en las unidades de milímetro por segundo (m/s).