استخدام هيستوتشيميستري الزنك متشابك للكشف عن مختلف المناطق وعن في الدماغ النامي والكبار
Summary
يصف لنا إجراء histochemical الذي يكشف عن الزنك الصفحي ومساحية مميزة تلطيخ أنماط في مناطق مختلفة من الدماغ. قد تستخدم نمط تلوين الزنك بالاقتران مع علامات تشريحية أخرى موثوق بها التمييز بين الطبقات والمناطق في الدماغ النامي والكبار.
Abstract
وصف المنظمة الدماغ التشريحية والوظيفية والتنمية يتطلب التحديد الدقيق للدوائر العصبية متميزة ومناطق في الدماغ غير ناضجة والكبار. هنا يصف لنا إجراء زنك المصبوغة histochemical الذي يكشف عن الاختلافات في أنماط المصبوغة بين طبقات مختلفة ومناطق الدماغ. الآخرين قد تستخدم هذا الإجراء ليس فقط لتكشف عن توزيع الدوائر في الدماغ والخلايا العصبية المحتوية على الزنك، ولكن أيضا لترسيم الحدود المساحية وطبقية في الدماغ النامي والكبار في العديد من الأنواع بنجاح. هنا يمكننا توضيح هذا تلطيخ الإجراء مع الصور من البلدان النامية والعقول النمس الكبار. ونحن تكشف عن نمط تلوين الزنك بمثابة علامة تشريحية للمناطق والطبقات، ويمكن استخدامها للتمييز بين المناطق القشرية البصرية في القشرة البصرية النامية والكبار موثوق بها. والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول هو تقديم أسلوب histochemical التي تسمح تحديد دقيق للطبقات والمناطق في الدماغ النامي والكبار حيث تفشل الطرق الأخرى للقيام بذلك. ثانوي، بالاقتران مع تحليل الصورة دينسيتوميتريك، هذا الأسلوب يسمح أحد لتقييم توزيع الزنك متشابك للكشف عن التغيرات المحتملة في جميع أنحاء التنمية. ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل الكواشف، والأدوات والخطوات اللازمة تباعا وصمة عار أقسام الدماغ المجمدة. على الرغم من أن يتم وصف هذا البروتوكول باستخدام أنسجة المخ النمس، بسهولة يمكن تكييفها للاستخدام في القوارض أو القطط أو القرود، وكذلك كما هو الحال في مناطق أخرى من الدماغ.
Introduction
وقد استخدمت تقليديا البقع النسيجي للمساعدة في تحديد المناطق القشرية في الأنواع المختلفة عن طريق الكشف عن الاختلافات في ملامح معمارية. الجمع بين استخدام تقنيات histochemical مثل لمادة نسل أو مفاعليه السيتوكروم أوكسيديز (CO)، أو المايلين يمكن أن يكون مثمرا كما أنها تكشف عن الحدود المساحية مشابهة في الدماغ الكبار. ومع ذلك، لا تكشف هذه البقع histochemical دائماً على نحو كاف حدود واضحة بين المناطق القشرية والطبقات في الدماغ غير ناضجة.
في الجهاز العصبي المركزي، الزنك لديه العديد من الوظائف الحيوية التي تشمل استقرار بنية الحمض النووي، بوصفها مساعد إنزيم، المشاركة في العديد من المهام التنظيمية، ووصفها نيورومودولاتور من خلال وجودها في حويصلات متشابك 1-الزنك متشابك فريدة من نوعها، فإنه يمكن تصور استخدام أساليب غذائها، بينما الزنك البروتين زمنياً لا يمكن تصور2. وقد استغلت هذه الميزة لتكشف عن نمط متشابك الزنك في مختلف المناطق القشرية، والزنك متشابك هيستوتشيميستري وقد استخدمت في عدد من الدراسات. مجموعة فرعية من جلوتاماتيرجيك الخلايا العصبية في قشرة الدماغ تحتوي على الزنك في الحويصلات presynaptic داخل تلك المحطات إكسون3،4. وقد كشفت الدراسات histochemical توزيع غير متجانس من الزنك متشابك في قشرة الدماغ5،،من67. يبدو أن هناك توزيعاً مساحية وطبقية مختلفة من الزنك هيستوتشيميكالي رد الفعل في مختلف المناطق القشرية (مثلاً، البصرية مقابل قشرة somatosensory)، أو طبقات (مثلاً، مستويات الزنك في سوبراجرانولار و إينفراجرانولار طبقات من القشرة البصرية الأولية أعلى بكثير من طبقة الإدخال الرابع ثالاموكورتيكال مع مستويات منخفضة نسبيا من الزنك متشابك)5،،من89. عدم تجانس في تلوين الزنك متشابك في القشرة مفيد خاصة حيث أنها تسهل تحديد مساحية وطبقية.
وهنا يقدم وصفاً مفصلاً لإجراء histochemical الزنك متشابك، ونسخة معدلة من دانشير في عام 1982 الأسلوب10. ويستخدم هذا الأسلوب سيلينيت حقن إينترابيريتونيلي (IP) إلى الحيوانات كعامل شيلاتينغ. سيلينيت يسافر إلى الدماغ لتتفاعل مع تجمعات الزنك الحرة الموجودة في حويصلات من مجموعة فرعية من جلوتاماتيرجيك نقاط الاشتباك العصبي في الدماغ. رد الفعل هذا غلة متسرعا التي يمكن تعزيزها بعد ذلك بوضع الفضة2،،من1011.
ويكشف هذا الإجراء الأنماط الصفحي والمساحية لتلوين الزنك متشابك؛ يمكن استخدام تحليل دينسيتوميتريك لتقييم هذه الأنماط كمياً ونوعيا في الدماغ الكبار وغير ناضجة لدراسة تأثيرات التدخلات الأخرى، مثل التلاعب الحسية والبيئية والدوائية، أو الوراثية. وعلاوة على ذلك، واحد قد تحتاج أيضا لتقييم التغيرات الإنمائية المحتملة في توزيع الزنك متشابك في الهياكل القشرية أو سوبكورتيكال الأخرى في نظم نموذجية أخرى. المعلومات الكمية التي يوفر تحليل دينسيتوميتريك في هذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة لنمو الدماغ التالية مع مرور الوقت. يوفر هذا البروتوكول مصاحب لغيرها المناعية-وعلامات histochemical للكشف عن حدود الصفحي والمساحية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتستخدم الدراسة الحالية أسلوب histochemical استناداً إلى نسخة معدلة من دانشير الأسلوب (1982)10، حيث يمكن الكشف عن التعريب الزنك متشابك وتصور في الدماغ. ويعمل هذا الأسلوب أساسا عن طريق حقن الحيوان مع سيلينيت الصوديوم تشيلاتور الزنك (نا2كبار المسئولين الاقتصاديين3) (15 مغ/كغ). ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها المنح المقدمة من المركز الوطني “بحوث الموارد” (2G12RR03060-26A1)؛ المعهد الوطني لصحة الأقليات والفوارق الصحية (8G12MD007603-27) من المعاهد الوطنية للصحة؛ الفنية موظفي الكونغرس-مدينة جامعة نيويورك (PSC-جامعة مدينة نيويورك)؛ وكلية البحوث منحة (FRG II) الجامعة الأمريكية في الشارقة. ونشكر سريراموجو النيابي على تقديمه لنا لهذه الأساليب.
Materials
| Euthasol (Euthanasia solution) | Henry Schein | 710101 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | 214485 | |
| Ketamine (Ketaved) | Henry Schein | 48858 | 100 mg/ml injectables |
| Xylazine (Anased) | Henry Schein | 33198 | 100 mg/ml injectables |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Dilute to 4% |
| Gum arabic | Sigma-Aldrich | G9752-500G | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C1909 | |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | W302600 | |
| Hydroquinone | Sigma-Aldrich | H9003 | |
| Silver lactate | Sigma-Aldrich | 85210 | |
| Fish gelatine | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C2506 | (Type III, from equine heart) |
| Catalse | Sigma-Aldrich | C10 | |
| Sucrose | Domino | ||
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used for dehydration prior to slide mounting |
| Coverslips | Brain Research Laboratories | #3660-1 | |
| Frosted unsubbed slides | Brain Research Laboratories | #3875-FR | |
| Microtome | American Optical Company | 860 | |
| Microscope | Olympus | BX-60 | |
| Adope Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images | |
| ImageJ | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | For densometric measurements | |
| Plastic tray | Any standard plastic tray may be used | to immerse slides in developer solution | |
| Hot plate | Any standard hotplate may be used |
Referenzen
- Nakashima, A., Dyck, R. H. Zinc and cortical plasticity. Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).
- Frederickson, C. J. Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons. Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).
- Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex. NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).
- Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity. J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).
- Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex. J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).
- Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse. Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).
- Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma). Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).
- Dyck, R., Cynader, M. An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex. Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).
- Land, P. W., Akhtar, N. D. Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex. Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).
- Danscher, G. Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds. Histochemistry. 76, 281-293 (1982).
- Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. The dithizone, Timm’s sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone. Histochemistry. 83, 419-422 (1985).
- Gallyas, F. Silver staining of myelin by means of physical development. Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development. J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).
- Ichinohe, N., Rockland, K. S. Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala. J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).
- Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).
- Khalil, R., Levitt, J. B. Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex. Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).
- Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius). Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).
- Wong, P., Kaas, J. H. Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.). The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).
- Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development. J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).
- Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex. J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).
- Timm, F. Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren. Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).
