Synthese und Bewertung von Ruthenium-basierte mitochondrialen Kalzium-Aufnahme-Hemmer
Summary
Ein Protokoll für die Synthese, Aufreinigung und Charakterisierung von einer Ruthenium-basierte Inhibitor der mitochondrialen Calciumaufnahme wird vorgestellt. Ein Verfahren zur Bewertung ihrer Wirksamkeit in permeabilized Säugerzellen wird demonstriert.
Abstract
Wir beschreiben die Synthese und Reinigung von eine mitochondriale Kalzium-Aufnahme-Hemmer, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)]5 +. Die optimierte Synthese dieser Verbindung beginnt ab [Ru (NH3)5Cl] Cl2 in 1 M NH4OH in einem geschlossenen Behälter, wodurch eine umweltfreundliche Lösung. Reinigung erfolgt mit Kationenaustausch Chromatographie. Diese Verbindung ist gekennzeichnet und rein sein von IR und UV-Vis Spektroskopie überprüft. Die mitochondriale Kalzium-Aufnahme hemmenden Eigenschaften sind in permeabilized HeLa-Zellen von Fluoreszenz-Spektroskopie bewertet.
Introduction
Mitochondriale Calcium ist ein wichtiger Regulator für eine Reihe von Prozessen, die entscheidend für die normale Zellfunktion, einschließlich Energieerzeugung und Apoptose sind. 1 , 2 , 3 die mitochondriale Kalzium Uniporter (MCU), ein Ion-Transporter-Protein, das auf der inneren mitochondrialen Membran befindet regelt den Zustrom von Calcium-Ionen in die Mitochondrien. 4 , 5 , 6 chemische Inhibitoren der MCU sind wertvolle Werkzeuge für die Fortsetzung der Bemühungen, die Funktion und die zellulären Funktionen dieses Transportprotein und mitochondriale Kalzium zu studieren. Die zusammengesetzten [(HCO2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(O2CH)]3 +, Ru360, gehört der einzige bekannteren selektive Inhibitoren für die MCU mit einem gemeldeten K-d -Wert von 24 µM.7 ,8,9,10 dieser Komplex eine gemeinsame Verunreinigung gefunden in kommerzielle Formulierungen von Ruthenium rot (RuRed), eine Triruthenium di-µ-Oxo ist überbrückt Hexacation der Formel [(NH3) 5 RU (µ-O) Ru (NH3)4(µ-O) Ru (NH3)5)]6 +, die auch als ein Kalzium-Aufnahme-Hemmer verwendet wurde. Obwohl Ru360 im Handel erhältlich ist, ist es sehr kostspielig. Darüber hinaus wird die Synthese und die Isolierung von Ru360 durch schwierige Reinigung Verfahren und mehrdeutige Charakterisierungsmethoden herausgefordert.
Vor kurzem haben wir alternative Verfahren eine Ru360 analog, [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5Zugriff auf berichtet. 11 diese Verbindung hemmt die MCU mit hoher Affinität, ähnlich wie bei Ru360. In diesem Protokoll beschreiben wir unsere effektivsten Synthese dieser Verbindung, die von [Ru (NH3)5Cl] Cl2beginnt. Reinigung des Produkts verwenden stark saure Kationenaustauschermembran Harz ist zusammen mit gemeinsamen Fallstricke für dieses Verfahren detailliert. Wir auch Methoden zur Charakterisierung und Beurteilung der zusammengesetzte Reinheit zu präsentieren und einen einfachen Ansatz, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Blockierung der mitochondrialen Calciumaufnahme abzugrenzen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die mitochondriale Kalzium Aufnahme-Hemmer [(OH-2) (NH3)4Ru (µ-O) Ru (NH3)4(OH-2)] Cl5 kann synthetisiert [Ru (NH3)5Cl] Cl2, ein bekannter ruthenium(III) Ausgangsmaterial, wie in diesem Verfahren beschrieben. Die Synthese von [Ru (NH3)5Cl] Cl2 gelingt leicht mit wenig Schwierigkeiten. Nach dem Rühren RuCl3 für 16 h in Hydrazin Hydrat, der pH-Wert der Lösung sollte a…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Cornell University unterstützt. Diese Arbeit von der Cornell-Center für Materialien geteilt Forschungseinrichtungen, Gebrauch gemacht, durch das NSF-MRSEC-Programm (Grant DMR-1120296) unterstützt werden. S.R.N. räumt Unterstützung durch eine NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE – 1650441) und Dr. Dave Holowka für die Unterstützung bei der Kalzium-Experimente. Jede Meinung, Erkenntnisse und Schlussfolgerungen oder Empfehlungen ausgedrückt in diesem Material sind diejenigen der Autoren (s) und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten von der National Science Foundation.
Materials
| Ruthenium Trichloride hydrate | Pressure Chemical | 3750 | |
| Concentrated hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535 | |
| Concentrated ammonium hydroxide | Mallinckrodt Chemical Works | A669C-2 1 | |
| Dowex 50 WX2 200-400 Mesh | Alfa Aesar | 13945 | |
| Calcium Green 5N | Invitrogen | C3737 | |
| Digitonin | Aldrich | 260746 | |
| DMSO | Aldrich | 471267 | |
| EGTA | Aldrich | E3889 | |
| KCl | USB | 20598 | |
| KH2PO4 | Aldrich | P3786 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 | |
| HEPES | Fluka | 54466 | |
| Sodium Succinate | Alfa Aesar | 33386 | |
| EDTA | J.T. Baker | 8993-01 | |
| Glucose | Aldrich | G5000 | |
| 200 Round bottom flask | ChemGlass | CG-1506-14 | |
| Glass stopper | ChemGlass | CG-3000-05 | |
| 10 mm x 15 cm glass column with reservoirs | Custom – similar to Chemglass columns | Similar to CG-1203-20 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 10437028 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| Round bottom Falcon tubes | Fisher Scientific | 14-959-11B | |
| 500 cm2 petri dishes | Corning | 431110 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Hemacytometer | Aldrich | Z359629 | |
| Acrylic Cuvettes | VWR | 58017-875 | |
| UV-Vis spectrometer | Agilent Model Cary 8454 | ||
| Spectrofluorimeter | SLM Model 8100C | ||
| IR spectrometer | Bruker Hyprion FTIR with ATR attachment | ||
| Centrifuge | ALC Model PM140R | ||
| Inverted light microscope | VWR | 89404-462 |
Referenzen
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