Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi
Summary
Biz insan kanında dolaşan nadir B hücreleri başlayarak insan antikorlar faiz, bir antijen için belirli üretim için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu doğal antikorlar nesil verimli ve hızlı ve elde edilen antikor arasında son derece ilgili antijenleri ayırt edebilirsiniz.
Abstract
Monoklonal antikor (mAbs) güçlü her iki temel araştırma ve Biyomedikal yararlı araçlardır. Antikor (örneğin, bir normal protein ve bunların mutasyona uğramış bir sürüm) son derece ilgili yapılar arasında ayırt etmek gerektiğinde yüksek olmalarından vazgeçilmezdir. Böyle discriminative mAbs üreten geçerli yolu, pahalı ve zaman alıcı olan birden fazla Ab üreten B hücrelerinin geniş tarama içerir. Biz burada tamamen insan mAbs B lenfositler dolaşan kan grubundan başlayan discriminative, nesil için hızlı ve uygun maliyetli bir yöntem öneriyorum. Diğer tüm hücrelerin hazır periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) kullanarak karşı seçim ile kombine spesifik antijen bağlayıcı B hücre seçimini bu strateji özgünlük kaynaklanmaktadır. Belirli B hücreleri izole olduğunda, karşılık gelen mAb için kodlama cDNA (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) dizileri tek hücre ters transkripsiyon-Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) teknolojisini kullanan ve daha sonra insan ifade elde edilir hücreleri. Gibi az içinde 1 ay olarak, doğal olarak B hücre repertuar tarafından algılanan hemen hemen herhangi bir istenen antijen karşı son derece discriminative insan mAbs miligram üretmek mümkündür.
Introduction
Burada açıklanan yöntemi istenen antijen (Ag) karşı tamamen insan Monoklonal antikor (mAbs) hızlı ve çok yönlü üretimini sağlar. mAbs birçok temel araştırma uygulamaları içinde in vitro ve in vivotemel araç vardır: Örneğin Akış Sitometresi, Histoloji, western Blot, engelleme deneyleri. Ayrıca, mAbs daha fazla tıpta otoimmün hastalıklar, kanser, tedavisi için ve nakli ret1kontrol etmek için kullanılıyor. Örneğin, anti-CTLA-4 ve anti-PD-1 (ya da anti-PD-L1) mAbs son zamanlarda kanser tedavileri2bağışıklık denetim noktası inhibitörleri olarak kullanılmıştır.
İlk mAbs immünglobulin (Ig) tarafından üretildi-hybridomas salgılayan aşılı fare ya da sıçan dalak hücrelerinden elde. Ancak, fare ya da sıçan mAbs karşı güçlü bağışıklık yanıtı hızlı onların temizlik ve aşırı duyarlılık reaksiyonları3olası indüksiyon nedeniyle insanlarda terapötik kullanımları engellemektedir. Bu sorunu çözmek için hayvansal protein dizileri mAbs kısmen sözde chimeric fare-insan veya insanlaşmış antikorlar oluşturmak için insan olanlar tarafından değiştirilmiş. Ancak, bu strateji yalnızca kısmen önemli ölçüde maliyet ve zaman ölçekli üretim artırırken immünojenisite, azaltır. İnsan mAbs doğrudan insan B hücreleri oluşturmak için daha iyi bir çözümdür ve bunun için çeşitli stratejiler mevcuttur. Onlardan biri fajının veya Maya display kullanımıdır. Bu rastgele insan IG ağır Kombinatorik kitaplığından değişken etki alanları görüntüleme içerir ve ışık phages veya Mayalar ve ilgi spesifik antijen kullanarak bir seçim adım taşıyan zincirleri. Bu stratejinin büyük bir dezavantaj ağır ve hafif zincirleri rastgele ilişkili, çok büyük bir artış için oluşturulan antikorlar çeşitlilik içinde lider olmasıdır. Elde edilen antikor üzerinden belirli bir Ag karşı doğal bir bağışıklık yanıtı ortaya çıkacak karşılık gelmesi olası değildir. Ayrıca, insan protein katlanması ve translasyonel modifikasyonlar sistematik olarak prokaryot ve Mayalar hatta çoğaltılamaz değil. İkinci bir insan mAb üretim yöntem doğal insan B hücreleri, Epstein – Barr virüsü enfeksiyonu veya anti-apoptotik faktörler BCL-6 ve BCL-XL4ifade tarafından əbadoləşdirmək olduğunu. Ancak, bu yöntem yalnızca bellek B hücreleri için geçerlidir ve az (varsa) mAb klonlar istenen antijenik özgüllük ile tanımlamak için çok sayıda mAb üreten ölümsüzleştirdi B hücreleri ile taranması gerektiren verimli değildir. Böylece pahalı ve zaman alıcı bir yöntemdir.
Yeni bir protokol son zamanlarda insan mAbs izole tek B hücreleri5üretiminin tarif edilmiştir. Bunun üzerine bir en iyi duruma getirilmiş tek hücreli ters transkripsiyon-Polimeraz zincir tepkimesi (RT-PCR) amplifikasyon her iki ağır – ve ışık-segmentleri bir tek sıralanmış B hücreden kodlama zinciri için dayanır. Bu böylece tamamen insan mAb yeniden inşası izin bir ökaryotik ifade sisteminde, klonlama ve ifade Bu kesimler tarafından takip ediyor. Bu iletişim kuralı başarıyla B hücreleri aşı bağışçılardan başlayarak kullanılmıştır. Hücreleri birkaç hafta sonra aşı B hücre istenen Ag karşı yönetmen yüksek frekansları almak ve böylece6eleme için gereken süreyi sınırlamak için hasat edildi. Tamamen insan diğer mAbs aynı zamanda enfekte HIV+ (insan immün yetmezlik virüsü) hastalar7 ve melanom hastalarda8üretilmektedir. Bu gelişmeler rağmen bu hala bir işlemdir Ag özgü B hücreleri kendi bellek fenotip veya frekans bağımsız yalıtım sağlayan kullanılabilir.
Prosedür tanımlamak burada verimli ex vivo yalıtım insan dolaşımdaki B hücreleri tamamen insan antijen spesifik mAbs yüksek verim ve düşük tarama süresi ile üretim ardından BCR olmalarından temel yol açar. Yöntem bellek B hücreleri veya antikor salgılayan B hücreleri bağışıklık yanıtının sonra indüklenen için sınırlı değildir, ama insan naif B hücre repertuar için de uygulanabilir. O bile Ag özgü B hücreleri çok düşük frekanslarda mevcut başlayarak inşaat verimlilik iyi bir göstergesidir. Yönteminin prensibi aşağıdaki gibidir: periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) iki tetramers faiz antijen sunan lekeli, her bir farklı fluorochrome ile (örneğin, Phycoerythrin (PE) ve Allophycocyanin (APC)), etiketli ve üçüncü bir tetramer yakından ilgili bir antijen sunan bir üçüncü fluorochrome ile (örneğin, parlak mor 421 (BV421)) Birleşik. Antijen bağlayıcı hücreleri için zenginleştirmek için hücreleri daha sonra anti-PE ile kaplı boncuk ile inkübe ve anti-APC Abs ve hücre ayrılık sütunlarda sıralanabilir. PE+ APC+ hücre kesir, mAbs farklı PBMC hücre türlerine B hücreleri tanımlanmasına izin özgü çeşitli lekeli ve tabi Akış Sitometresi hücre sıralama için seçilir. PE+ ve APC+, parlak mor–, ama olan B hücreleri izole edilmiştir. Bu adımı karşı olan B hücreleri olmayan veya tetramerized antijen bind yapmak ama ya PE veya APC (Bu hücreler PE+ APC– veya PE– +APC olacak) veya tetramers (Bunlar kullanılan antijen parçası bağlamak hücreleri seçer hücre-ecek var olmak BV421+). B hücreleri değil son derece ilgi epitope için belirli karşı bu adımda belirlenmişse de (Bu hücreler-ecek da var olmak BV421+). Bu nedenle, bu yöntem B-hücre reseptörleri (BCRs) iki çok yakından ilgili antijenleri arasında ayrımcılık mümkün ifade son derece belirli B hücreleri arındırmak. Tek belirli B hücreleri tüplerde toplanır ve onların PCR güçlendirilmiş IG cDNAs (tamamlayıcı deoksiribonükleik asit) klonlanmış ve tarafından salgılanan IgG mAbs insan hücre çizgilerle ifade.
Kavramının bir kanıtı olarak, bu çalışmada bir peptid ben MHC kompleksi sınıf tarafından sunulan tanıyan insan mAbs, verimli nesil açıklar (MHC-ben) molekül ve bu peptid ve aynı yüklü diğer peptidler arasında ayırt edebilirsiniz MHC-ben gen. Bu AG karmaşıklık düzeyi önemli olmakla birlikte, bu yöntem, (i) Ag özel mAbs yüksek verimli kurtarma sağlar; (ii) üretim mAbs iki yapısal olarak yakın Ags arasında ayırımcılık yapması mümkün. Bu yaklaşım herhangi bir iletişim kuralı yapılmaksızın aşı veya enfekte hastalar için genişletilmiş ve ayrıca zaten başarıyla bir insanlaşmış sıçan sistem9‘ uygulamaya konmuştur. Böylece, bu çalışmada temel araştırma ve immünoterapi kullanılabilir tamamen insan mAbs oluşturmak için çok yönlü ve verimli bir yaklaşım açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önerilen protokol doğrudan kanda dolaşan Ag özgü B hücreleri insan mAbs üretimi için güçlü bir yöntem olmasıdır. Bu üç önemli yönleri birleştirir: (i) bile nadir Ag bağlayıcı B hücreleri; bir ex vivo yalıtım sağlayan bir tetramer ilişkili manyetik zenginleştirme, kullanımı (II) etiketli üç Ag tetramers (iki ilgili olanlar ve bir alakasız bir) ile üç farklı fluorochromes izole, Akış Sitometresi tarafından yalnızca B hücreleri BCR belirli istenen Ag için bir ifade kullanı…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sitometresi tesis “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) uzman teknik destek için teşekkür ederiz. Ayrıca tüm personel rekombinant protein üretim (P2R) ve etkisi platformları (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) onların teknik destek için teşekkür ederiz. Biz Emmanuel Scotet ve Richard Breathnach el yazması yapıcı yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser mali Fransız Ulusal araştırma Ajansı (ANR tarafından) (ANR-10-IBHU-005) yönetilen «Investissements d’Avenir» Fransız hükümeti programı tarafından finanse edilen IHU Cesti projesi tarafından desteklenmiştir. IHU Cesti projesi de Nantes Métropole ve Région Pays de la Loire tarafından desteklenmektedir. Bu eser gelecek program ANR-11-LABX-0016-01 yatırım üzerinden ulusal araştırma ajansı tarafından desteklenen LabEX IGO program kapsamında gerçekleşmiştir.
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
Referenzen
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
