血液循环中稀有抗原特异 B 细胞的鉴别人单克隆抗体的生成
Summary
我们描述了一种生产人类抗体特异性抗原的方法, 从人类血液中的稀有 B 细胞开始。这些天然抗体的产生是高效和快速的, 而获得的抗体可以区分高度相关的抗原。
Abstract
单克隆抗体 (抗体) 是一种强有力的工具, 对基础研究和生物医学都很有用。当抗体需要区分高度相关的结构 (如、正常蛋白质和其突变版本) 时, 它们的高特异性是不可或缺的。目前产生这种歧视性抗体的方法包括广泛筛选多 Ab 生产的 B 细胞, 这既费钱又费时。本文提出了一种快速、成本效益高的方法, 从人血循环 B 淋巴细胞出发, 对人类抗体进行区分。这一策略的独创性是由于选择了特定的抗原结合 B 细胞结合所有其他细胞的反选择, 使用现成的外周血单个核细胞 (PBMC)。一旦分离出特定的 B 细胞, 使用单细胞逆转录-聚合酶链反应 (rt-pcr) 技术, 在人体内表达 cDNA (互补脱氧核糖核酸) 序列细胞.在短短的1月内, 有可能产生毫克的高度歧视性的人类抗体针对几乎任何所需的抗原自然检测的 B 细胞的剧目。
Introduction
这里描述的方法允许快速和多才多艺的生产完全人的单克隆抗体 (抗体) 反对期望抗原 (Ag)。抗体是许多基础研究应用的重要工具在体外和在体内: 流式细胞术, 组织学, 西部印迹, 和阻断实验, 例如。此外, 抗体正在越来越多地用于治疗自身免疫性疾病, 癌症, 并控制移植排斥1。例如, anti-CTLA-4 和 anti-PD-1 (或 anti-PD-L1) 抗体最近被用作癌症治疗的免疫检查站抑制剂2。
第一抗体是由免疫球蛋白 (Ig) 分泌的杂交从脾细胞中获得的小鼠或大鼠。然而, 强的免疫反应对鼠或大鼠抗体阻碍他们的治疗用途在人, 由于他们的快速的清除和可能的感应性过敏反应3。为了解决这个问题, 动物蛋白序列的抗体已部分被人类的替代, 以产生所谓的嵌合体的小鼠-人类或人性化的抗体。然而, 这一战略只部分降低了免疫原性, 同时大大增加了成本和生产的时间尺度。一个更好的解决方案是直接从人类 B 细胞中生成人抗体, 并提供了几种策略。其中之一是使用噬菌体或酵母显示。这包括在噬菌体或酵母中的随机人类 Ig 重和轻链的组合库中显示可变域, 并使用特定的兴趣抗原进行选择步骤。这一战略的一个主要缺点是, 重和轻链随机关联, 导致一个非常大的增加, 产生抗体的多样性。获得的抗体不太可能与天然免疫应答对某一特定的 Ag 产生的反应相对应。此外, 人类蛋白质折叠和后转化的修改没有系统地复制在原, 甚至在酵母。第二个人类单克隆生物的生产方法是永生的自然人 B 细胞, 由 eb 病毒感染或表达的抗凋亡因素 BCL-6 和总格-XL4。然而, 这种方法仅适用于记忆 b 细胞, 而且效率低下, 需要筛选出大量的单克隆抗体生成永生化 b 细胞, 以确定少数 (如果有的话) 克隆人的抗原特异性。因此, 这种方法既费钱又耗时。
一个新的协议最近被描述用于生产人类抗体从孤立的单一 B 细胞5。它依赖于一个优化的单细胞逆转录聚合酶链反应 (RT PCR) 放大的重和轻链编码段从一个单一的排序 B 细胞。其次是在一个真核表达系统中, 这些片段的克隆和表达, 从而允许重建一个完全人类的单克隆。该协议已成功地用于从接种疫苗的捐献者 B 细胞开始。在接种疫苗数周后, 细胞获得了针对所需 Ag 的 B 细胞的更高频率, 从而限制了筛查6所需的时间。其他完全人类抗体也已经产生了艾滋病毒的+ (人体免疫缺陷病毒) 感染患者的7和黑色素瘤患者8。尽管有这些进展, 仍然没有可用的程序, 可以独立于其记忆表型或频率的 Ag 特定 B 细胞的分离。
这里描述的过程导致了有效的体外分离人循环 B 细胞基于他们的 BCR 特异性, 其次生产完全人抗原特异抗体在高产和以低筛选时间. 该方法不限于记忆 b 细胞或抗体分泌 b 细胞后诱导免疫应答, 但也可以应用于人类的幼稚 b 细胞的剧目。它运作甚而从 Ag 特定 B 细胞存在在非常低频率是它的效率的一个好征兆。该方法的原理如下: 外周血单个核细胞 (PBMC) 染色的两个体呈现的抗原的兴趣, 每个标记有不同的荧光 (例如, 藻 (PE) 和复方 (APC)),和第三聚丙烯提出一个紧密相关的抗原共轭与第三荧光 (如, 高明紫 421 (BV421))。为了丰富抗原结合细胞, 细胞然后孵化的珠子涂敷反 PE 和反 APC Abs, 并排序在细胞分离列。选择 PE+ APC+单元格部分, 用各种不同的抗体特定的 PBMC 细胞类型进行染色, 以允许识别 B 细胞, 并进行流式细胞仪细胞分类。B 单元格是 PE+和 APC+, 但明亮的紫罗兰–是孤立的。此步骤计数器-选择不是 B 细胞或不绑定到 tetramerized 抗原的细胞, 但要绑定到 pe 或 apc (这些单元格将是 pe+ apc–或 pe apc+), 或者是使用体的非抗原部分 (这些单元格将 BV421+)。B 细胞不是高度具体的表位的兴趣也是计数器选择在此步骤 (这些单元也将是 BV421 的+)。因此, 这种方法可以纯化高特异 b 细胞表达 b 细胞受体 (BCRs) 能够区分两个非常密切的相关抗原。在试管中收集单个特定的 B 细胞, 并将其 PCR 扩增的 Ig 基因 (补充脱氧核糖核酸) 克隆出来, 由人类细胞系作为分泌的 IgG 抗体表达。
作为概念的证明, 本研究描述了人类抗体的有效生成, 它能识别出由一个主要的组织相容性复合 i 类 (MHC i) 分子所呈现的肽, 并能区别这一肽和其他加载在同一MHC I 等位基因。虽然这个 ag 的复杂程度是重要的, 这个方法允许 (i) ag 特定抗体的高收率的补救;(二) 生产抗体能够区分两个结构密切 Ags。这种方法可以扩大到接种疫苗或感染的病人没有任何协议的修改, 也已经成功地实现了一个人性化的大鼠系统9。因此, 这项研究描述了一个多才多艺的和有效的方法, 以产生充分的人类抗体, 可用于基础研究和免疫治疗。
Protocol
根据当地道德委员会 (景区法国, EFS, 南特, 程序采样 NTS-2016-08), 所有的人外周血样本都是在知情同意后从匿名成年献血者那里获得的。 1. 人外周血单个核细胞的分离 注: 起始物料可为总人外周血或 cytapheresis 样。样品不应超过8小时, 并辅以抗凝血剂 (例如, 肝素)。 稀释血液与2容量 (人的外周血) 或5容量 (cytapheresis 样品) RPMI (罗斯威尔公园纪念…
Representative Results
从 PBMC 从健康捐赠者开始, 这个项目提出了人类抗体的世代, 它认可肽 Pp65495 (Pp65, 从人巨细胞病毒) 提出由主要的组织相容性复合 i 类 (MHC i) 分子 HLA-A*0201 (HLA-A2)。这些抗体可以区分这一复杂和代表其他肽加载到同一 MHC I 分子的络合物。 PBMC 被 HLA-A2/Pp65-PE、HLA-A2/Pp65-APC 和 HLA-A2/MelA2-BV421 体染色, 如上述协议所述。聚丙烯?…
Discussion
所提出的协议是一种强有力的方法, 产生的人抗体直接从 Ag 特定的 B 细胞循环血液。它结合了三重要的方面: (i) 使用聚丙烯相关的磁性富集, 它允许对甚至稀有的银结合 B 细胞的ex 体内隔离;(二) 采用三 ag 体 (两个相关的和一个不相关的) 的门控策略, 用三种不同的荧光来隔离, 用流式细胞仪, 只对所需的 ag 表达一个 BCR 特异的 B 细胞;(iii) 用 rt-pcr 技术在单细胞水平上重建相应的重组单克隆人?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢细胞仪设备 “CytoCell” (SFR Santé, Biogenouest, 南特) 的专家技术援助。我们还感谢所有的重组蛋白生产 (P2R) 和冲击平台 (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, 南特) 的工作人员的技术支持。我们感谢伊曼纽尔 Scotet 和理查德 Breathnach 对手稿的建设性评论。这项工作的财政支持 IHU-Cesti 项目资助的« Investissements 艾文莉»法国政府计划, 由法国国家研究机构 (ANR-10-IBHU-005) 管理。IHU-Cesti 项目也得到了南特 Métropole 和 Région 支付 de la 卢瓦尔的支持。这项工作是在国家研究机构通过对未来项目 ANR-11-LABX-0016-01 的投资支持的 LabEX 总检办方案的背景下实现的。
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
Referenzen
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- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
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Diesen Artikel zitieren
Devilder, M., Moyon, M., Saulquin, X., Gautreau-Rolland, L. Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood. J. Vis. Exp. (132), e56508, doi:10.3791/56508 (2018).