جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم
Summary
يصف لنا طريقة لإنتاج أجسام مضادة بشرية محددة مستضد الاهتمام، بدءاً من الخلايا ب نادرة المتداولة في الدم البشري. جيل من هذه الأجسام المضادة الطبيعية بكفاءة وسرعة، والأجسام المضادة التي تم الحصول عليها يمكن أن تميز بين المستضدات المتصلة بدرجة عالية.
Abstract
[مونوكلونل] (مابس) أدوات قوية مفيدة لكلا من البحوث الأساسية، وفي الطب الحيوي. خصوصيتها العالية أمر لا غنى عنه عند الجسم يحتاج إلى التمييز بين الهياكل ذات الصلة العالية (مثلاً، بروتين عادي وتحور نسخة منه). الطريقة الحالية لتوليد مثل هذه مابس التمييزية ينطوي فحص واسعة النطاق متعددة الخلايا المنتجة لأب ب، ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء. ونحن نقترح هنا طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد التمييزية، مابس البشرية الكامل بدءاً من الدم البشري تعميم لمفاوية ب. أصالة هذه الاستراتيجية سبب اختيار محددة مستضد ملزمة ب الخلايا جنبا إلى جنب مع التحديد مكافحة كافة الخلايا الأخرى، استخدام متاحة الطرفية الدم وحيدات النوى خلايا (ببمك). مرة واحدة محددة ب الخلايا المعزولة، يتم الحصول على تسلسلات كدنا (تكميلية الحمض الخلوي الصبغي) الترميز ماب المقابلة استخدام تكنولوجيا عكس النسخ-“تفاعل البوليميراز المتسلسل” (RT-PCR) خلية مفردة، وأعربت في وقت لاحق في الإنسان الخلايا. خلال أقل من شهر واحد، فمن الممكن تنتج ملليغرام من مابس البشرية عالية التمييزية ضد أي مستضد المطلوب الكشف عنها بطبيعة الحال بواسطة مرجع الخلية ب.
Introduction
الأسلوب الموصوفة هنا يسمح إنتاج مونوكلونل البشرية الكامل (مابس) ضد مستضد المطلوب (Ag) السريع وتنوعاً. مابس أدوات لا غنى عنها في العديد من تطبيقات البحوث الأساسية في المختبر و في فيفو: التدفق الخلوي، وعلم الأنسجة، والتجارب الغربية النشاف، وحظر على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، مابس تستخدم أكثر فأكثر في الطب لعلاج أمراض المناعة الذاتية، السرطان، ومراقبة زرع الرفض1. على سبيل المثال، استخدمت مؤخرا مابس 4-مكافحة-كتلاً ومكافحة-PD-1 (أو مكافحة-PD-L1) كمثبطات محصنة ضد نقطة تفتيش في علاجات السرطان2.
مابس الأولى تم إنتاجها بواسطة الغلوبولين المناعي (Ig)-إفراز هيبريدوماس التي تم الحصول عليها من خلايا الطحال المحصنين الفئران أو الجرذان. ومع ذلك، يعوق الاستجابة المناعية القوية ضد مابس الفئران أو الجرذان استعمالها العلاجي في البشر، وسبب بهم التخليص السريع وتحريض محتمل من تفاعلات فرط الحساسية3. لمعالجة هذه المشكلة، استبدلت تسلسل البروتين الحيواني مابس جزئيا بالبشرية منها لإنشاء ما يسمى تشيميريك الإنسان الماوس أو أنسنة الأجسام المضادة. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية جزئيا فقط يقلل الاستمناع، مع زيادة كبيرة في التكلفة والجدول الزمني للإنتاج. حل أفضل لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا ب البشرية وتتوافر استراتيجيات عدة لهذا. واحد منهم هو استخدام عرض بالعاثية أو الخميرة. وهذا ينطوي على عرض مجالات متغير من مكتبة اندماجي عشوائي Ig البشرية الثقيلة وسلاسل الضوء على فاجيس أو الخمائر، والقيام بخطوة اختيار استخدام مستضد معين من الفائدة. عيب رئيسي لهذه الاستراتيجية أن السلاسل الثقيلة والخفيفة وترتبط عشوائياً، مما أدى إلى زيادة كبيرة جداً في تنوع الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها. الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من المحتمل أن تقابل تلك التي ستنشأ عن استجابة جهاز المناعة طبيعية ضد أغ خاصة. وعلاوة على ذلك، طي البروتين البشري والتعديلات بوستترانسلاشونال لا بانتظام مستنسخة في بدائيات النوى، أو حتى في الخمائر. أسلوب إنتاج البشري ماب ثاني هو تخليد للخلايا البشرية الطبيعية ب، بعدوى فيروس ابشتاين-بار أو التعبير عن العوامل المضادة-apoptotic BCL-6 و BCL-XL4. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا ينطبق إلا على خلايا الذاكرة ب وغير الفعالة، التي تتطلب فحص العديدة المنتجة للإنسان والمحيط الحيوي مخلدة ب الخلايا لتحديد المستنسخين ماب قليلة (أن وجدت) مع خصوصية مستضدي المرجوة. الأسلوب وبالتالي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء.
ووصف مؤخرا بروتوكولا جديداً لإنتاج مابس البشرية من خلايا ب مفردة معزولة5. وهي تعتمد على محسن خلية واحدة عكس النسخ-“تفاعل البوليميراز المتسلسل” (RT-PCR) للتضخيم من كلا الثقيلة-والضوء-سلسلة ترميز شرائح من خلية واحدة بتم فرزها. وهذا يعقب بالاستنساخ والتعبير عن هذه الأجزاء في نظام تعبير حقيقية النواة، مما يسمح لتعمير ماب البشرية الكامل. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح بدءاً من الخلايا ب من المانحين جرى تطعيمهم. كانت حصاد الخلايا بعد التطعيم للحصول على ترددات أعلى من الخلايا ب الموجهة ضد النائب العام المطلوب، وبالتالي الحد من الوقت اللازم لفحص6أسابيع عدة. كما تم إنتاج أخرى مابس البشرية الكامل من فيروس نقص المناعة البشرية+ (فيروس نقص المناعة البشرية) إصابة المرضى7 وسرطان الجلد المرضى8. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، لا يزال هناك لا الإجراءات المتاحة التي تمكن من عزل خلايا ب Ag على حدة مستقلة عن النمط الظاهري الذاكرة أو التردد.
ووصف الإجراء هنا يؤدي إلى كفاءة السابقين فيفو عزل الخلايا ب تعميم البشرية استناداً إلى خصوصيتها في المركز، تليها إنتاج البشرية الكامل محددة مستضد مابس في عالية الغلة ومع وقت فحص منخفضة. الأسلوب لا يقتصر على الذاكرة ب الخلايا أو الخلايا ب إفراز الأجسام المضادة التي يسببها بعد استجابة مناعية، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على مرجع الخلية بالسذاجه البشرية. أنه يعمل حتى بدءاً من الخلايا الخاصة بحج ب حاضرا في الترددات المنخفضة جداً مؤشر جيد لكفاءتها. ومبدأ الأسلوب كما يلي: ملطخة الخلايا وحيدات النوى الدم طرفية (PBMC) مع اثنين تيتراميرس عرض المستضد الفائدة، وبعضها يحمل فلوروتشرومي مختلفة (مثلاً، فيكوريثرين (PE) واللوفيكوسيانين (APC))، وأن تيترامير ثالث عرض مستضد وثيق صلة مترافق مع فلوروتشرومي ثالث (مثلاً، Brillant البنفسجي 421 (BV421)). لإثراء لخلايا مستضد ملزمة، ثم هي المحتضنة الخلايا مع حبات مغلفة بمكافحة-PE وتقاسم المنافع المضادة-آسيا والمحيط الهادئ، وفرزها في الخلية الفصل بين الأعمدة. يتم تحديد الكسر خلية APC PE+ + ، الملون مع مجموعة متنوعة من مابس المحددة لمختلف أنواع الخلايا ببمك للسماح بتحديد الخلايا ب، ويتعرض للتدفق الخلوي الخلية الفرز. خلايا ب PE+ والجيش الشعبي الكونغولي+، لكن “البنفسجي الرائعة”–، يتم عزل. هذه الخطوة تحديد مكافحة الخلايا التي ليست خلايا ب أو عدم ربط مستضد تيتراميريزيد، ولكن ربط إلى بي أو آسيا والمحيط الهادئ (ستكون هذه الخلايا PE+ الجيش الشعبي الكونغولي– أو PE– الجيش الشعبي الكونغولي+) أو إلى الجزء غير مستضد tetramers المستخدمة (وهذه وسوف تكون الخلايا BV421+). كما يتم تحديد الخلايا ب ليست محددة للغاية حانمه مصلحة مكافحة في هذه الخطوة (وستكون هذه الخلايا أيضا BV421+). وهكذا، هذا الأسلوب يمكن تنقية الخلايا ب محددة للغاية معربا عن مستقبلات الخلية ب (بكرس) قادرة على التمييز بين اثنين من مولدات المضادات ذات صلة وثيقة جداً. يتم جمع الخلايا ب محددة واحدة في أنابيب وعلى تضخيم PCR Ig كدناس (الأحماض منقوص الأكسجين التكميلية) المستنسخة وأعرب عنها خط خلية بشرية يفرز مفتش مابس.
كدليل على المفهوم، توضح هذه الدراسة كفاءة توليد مابس البشرية، التي تعترف ببتيد التي قدمها فئة histocompatibility رئيسية معقدة (MHC–أنا) جزيء ويمكن أن تميز بين هذا الببتيد وغيرها الببتيدات محملة على نفس MHC–أنا اليل. على الرغم من أهمية مستوى تعقيد هذا Ag، يسمح هذا الأسلوب (ط) الانتعاش عالية الغلة من مابس Ag على حدة؛ (ثانيا) إنتاج مابس قادرة على التمييز بين اثنين Ags هيكلياً الوثيق. هذا النهج يمكن تمديدها للمرضى الذين جرى تطعيمهم أو المصابة دون أي تعديل البروتوكول، ولديها أيضا الفعل نفذت بنجاح في نظام جرذ أنسنة9. وهكذا، تصف هذه الدراسة اتباع نهج مرنة وفعالة لتوليد مابس البشرية الكامل الذي يمكن استخدامه في البحوث الأساسية والعلاج المناعي.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول المقترح وسيلة قوية لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا الخاصة بحج ب المتداولة في الدم. فهو يجمع بين ثلاثة جوانب هامة: (ط) استخدام المرتبطة تيترامير المغناطيسي تخصيب اليورانيوم، الذي يسمح لعزل السابقين فيفو نادرة حتى ب Ag ملزم الخلايا؛ (ثانيا) استراتيجية النابضة يستخدم ثل?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر المرفق الخلوي “سيتوسيل” (الصحة فرنك سويسري، بيوجينويست، نانت) لخبراء المساعدة التقنية. ونشكر أيضا جميع موظفي إنتاج البروتين المؤتلف (P2R) ومنصات الأثر (INSERM 1232، الصحة فرنك سويسري، بيوجينويست، نانت) لتقديم الدعم التقني لهم. ونحن نشكر ستيت إيمانويل وريتشارد بريثناتش للتعليقات البناءة على المخطوطة. وأيد هذا العمل ماليا سيستي رامي المشروع الممول من قبل برنامج “الحكومة الفرنسية” «يشرف دعفينير»، تمكنت من الفرنسية الوطنية بحوث الوكالة (ANR-10-إيبهو-005). رامي-سيستي المشروع تدعمه أيضا نانت متروبول وضمور يدفع de la Loire. وأدرك هذا العمل في سياق البرنامج IGO لابيكس تدعمها الوكالة الوطنية للبحوث عن طريق استثمار البرنامج مستقبلا ANR-11-لابكس-0016-01.
Materials
| HEK 293A cell line | Thermo Fisher scientific | R70507 | |
| DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco by life technologies | 21969-035 | (+) 4,5g/L D-Glucose 0,11g/L Sodium Pyruvate (-) L-Glutmine |
| RPMI medium1640 (1X) | Gibco by life technologies | 31870-025 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | PAA | K45-001 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | 100X Conc |
| PBS-Phosphate Buffered Saline (10X) pH 7,4 | Ambion | AM9624 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) 0,5M pH=8 | Invitrogen by Life Technologies | 15575-020 | |
| Fetal Bovine serum (FBS) | Dominique Dutscher | S1810-500 | |
| Ficoll – lymphocytes separation medium | EuroBio | CMSMSL01-01 | density 1,0777+/-0,001 |
| streptavidin R-phycoerythrin conjugate | Invitrogen by Life Technologies | S21388 | premiun grade 1mg/ml contains 5mM sodium azide |
| Streptavidin, allophycocyanin conjugate | Invitrogen by thermoFisher scientific | S32362 | 1mg/ml 2mM azide premium grade |
| Brilliant violet 421 streptavidin | Biolegend | 405225 | conc : 0,5mg/ml |
| Anti-PE conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-APC conjugated magnetic MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-855 | |
| MidiMACs or QuadroMACS separotor | Miltenyi Biotec | 130-042-302/130-090-976 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| CD3 BV510 BD horizon | BD Pharmingen / BD Biosciences | 563109 | Used dilution 1:20 |
| CD19 FITC | BD Pharmingen / BD Biosciences | 345788 | Used dilution 1:20 |
| CD14 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 561116 | Used dilution 1:50 |
| CD16 PerCPCy5.5 | BD Pharmingen / BD Biosciences | 338440 | Used dilution 1:50 |
| 7AAD | BD Pharmingen / BD Biosciences | 51-68981E (559925) | Used dilution 1:1000 |
| FACS ARIA III Cell Sorter Cytometer | BD Biosciences | ||
| 8-strip PCR tubes | Axygen | 321-10-061 | |
| Racks for 96 microtubes | Dominique Dutscher | 45476 | |
| RNAseOUT Ribonuclease Inhibitor (recombinant) | Invitrogen by thermoFisher scientific | 10777-019 | qty:5000U (40U/ul) |
| Distilled Water Dnase/Rnase Free | Gibco | 10977-035 | |
| Oligod(T)18 mRNA Primer | New England BioLabs | S1316S | 5.0 A260unit |
| Random hexamers | Invitrogen by thermoFisher scientific | N8080127 | qty : 50uM, 5nmoles |
| Superscript III Reverse transcriptase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 18080-044 | qty : 10000U (200U/ul) |
| GoTaq G2 Flexi DNA polymerase | Promega | M7805 | |
| dNTP Set, Molecular biology grade | Thermo Scientific | R0182 | 4*100umol |
| 5LVH1 | Eurofins | ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH3 | Eurofins | AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVL4_6 | Eurofins | CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 5LVH5 | Eurofins | CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers – Forward Prmers |
| 3HuIgG_const_anti | Eurofins | TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig- Bacteria PCR screening |
| 3CuCH1 | Eurofins | GGGAATTCTCACA GGAGACGA |
First round of PCR – Amplification of heavy chains – Outer primers -Reverse primers for human Ig |
| 5AgeIVH1_5_7 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3_23 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGTTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH4_34 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_18 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH1_24 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH3__9_30_33 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 5AgeIVH6_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Forward primers |
| 3SalIJH1_2_4_5 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH3 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 3SalIJH6 | Eurofins | TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG |
Second round of PCR – Amplification of heavy chains – Inner primers -Reverse primers |
| 5'LVk1_2 | Eurofins | ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk3 | Eurofins | CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVk4 | Eurofins | ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Forward primers |
| 3'Ck543_566 | Eurofins | GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA |
First round of PCR – Amplification of light chains k – Outer primers -Reverse primers- Bacteria PCR screening |
| 5'AgeIVk1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1_9_1–13 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk1D_43_1_8 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeIVk2_28_2_30 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_11_3D_11 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_15_3D_15 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk3_20_3D_20 | Eurofins | TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'AgeVk4_1 | Eurofins | CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk1_2_4 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk3 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TGATATCCACTTTGGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 3'BsiWIJk5 | Eurofins | GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC |
Second round of PCR – Amplification of light chains k – Inner primers -Forward primers |
| 5'LVl1 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl2 | Eurofins | GGTCCTGGGCCCA GTCTGCCCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl3 | Eurofins | GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl4_5 | Eurofins | GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl6 | Eurofins | GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'LVl7 | Eurofins | GGTCCAATTCYCA GGCTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5LVl8 | Eurofins | GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 3'Cl | Eurofins | CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG |
First round of PCR – Amplification of light chains λ – Outer primers -Forward primers |
| 5'AgeIVl1 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl2 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl3 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl4_5 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl6 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 5'AgeIVl8 | Eurofins | CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -forward primers |
| 3'XhoICl | Eurofins | CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG |
Second round of PCR – Amplification of light chains λ – Inner primers -Reverse primers – Bacteria PCR screening |
| Ab-vec-sense | Eurofins | GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC |
Bacteria PCR screening |
| QA Agarose-TM, Molecular Biology Grade | MP Bio | AGAH0500 | |
| NucleoFast 96 PCR Plate | Macherey Nagel | 743.100.100 | |
| Enzyme Age I HF | New England Biolabs | R3552L | 20000U/ml |
| Enzyme SalI HF | New England Biolabs | R3138L | 20000U/ml |
| Enzyme Xho I | New England Biolabs | R0146L | 20000U/ml |
| Enzyme BSIWI | New England Biolabs | R0553L | 10000U/ml |
| HCg1 (Genbank accession number FJ475055) | |||
| LCk (Genbank accession number FJ475056 ) | |||
| LCl (Genbank accession number FJ517647) | |||
| T4 DNA ligase | Invitrogen by thermoFisher scientific | 15224.017 | 100U (1U/ul) |
| 2X YT medium | Sigma Aldrich | Y1003-500ML | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 10835242001 | |
| LB (Luria Bertani) Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-250G | |
| Nucleospin Plasmid DNA, RNA and protein purification | Macherey Nagel | 740588.250 | |
| Jet PEI DNA transfection reagent | PolyPlus | 101-40 | |
| Flat bottom96-well plate | Falcon | 353072 | |
| V-bottom 96-well plate | Nunc/Thermofisher | 055142 | |
| Nunc easy 175 cm2 flasks | Nunc/Thermofisher | 12-562-000 | |
| ELISA/ELISPOT coating buffer | eBiosciences | 00-0044-59 | |
| Nunc maxisorp flat bottom 96 well ELISA plates | Nunc/Thermofisher | 44-2404-21 | high protein binding |
| Anti-human IgG Ab conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | BD Pharmingen / BD Biosciences | 55788 | |
| TMB substrate | BD Biosciences | 555214 | |
| Streptavidin | Sigma | S0677 | |
| 1 mL-HiTrap protein A HP column | GE Healthcare | 17-0402-01 | |
| ÄKTA FPLC | GE Healthcare | 18190026 | |
| Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17517501 | |
| NGC Quest 10 Plus Chromatography System | BioRad | 7880003 |
Referenzen
- Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
- Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
- Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
- Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
- Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
- Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
- Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532 (2011).
- Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
- Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3 (2017).
- Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
- Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
- Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
- Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).
