JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetik

Nematot Caenorhabditis Elegans - konak-mikrop etkileşimleri çalışmaya çok yönlü Vivo içinde manken

Published: October 18, 2017
doi:
10.3791/56487
, ,
1Biology and Biotechnology,Worcester Polytechnic Institute

Summary

Burada, mikrobiyal etkileşim çalışmaya çok yönlü ana model olarak Caenorhabditis elegans Yuvarlak solucanlar mevcut.

Abstract

Biz Caenorhabditis elegans mikrobiyal etkileşim çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak kullanarak bir yöntem göstermek. Mikroplar bağırsak hastalığı için birincil konumunu yaparak diyet ile tanıtılmaktadır. Nematot bağırsak yapısal ve işlevsel olarak memeli bağırsak taklit ve yapım o mükellef kolonizasyon mikroskobik incelenmesi için saydamdır. İşte patojenler hastalık ve ölüm neden olabilir göstermektedir. Değiştirilmiş virülans göstermek mikrobiyal mutantlar tespit edebiliyoruz. Biyotik streslere korunmuş onun doğuştan gelen yanıt C. elegans ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık etkileşimleri yönleriyle araştırmak için mükemmel bir sistem yapar. Gösterdiğimiz ev sahipliği yapan çift oksidaz gen mutasyonları ile Reaktif oksijen türleri üretemez ve mikrobiyal hakaret direnmek mümkün değildir. Daha fazla çok yönlülük sunulan hayatta kalma testin inhibitörlerinin mikrobiyal büyüme etkileri çalışma için kullanılabilir göstererek göstermektedir. Bu tahlil yanı sıra roman antifungal ajanların gelişim için hedefler olarak mantar virülans faktörleri keşfetmek daha fazla ana bilgisayar-mikrop etkileşimleri ortaya çıkarmak için bir fırsat sağlamak için de kullanılabilir. Cryo-koru solucanlar ileride kullanmak için yetenek çalışmak için bir maliyet-etkin ve çekici bütün hayvan modeli yapar iken bu tahlil tasarımını de yüksek üretilen iş için bütün-genom ekranlar, ödünç vermek kendisi.

Introduction

C. elegans 50 yıldan fazla bir güçlü model organizma kullanılmıştır. 1960’larda, Güney Afrikalı biyolog Sydney Brenner hücre ve hayvan biyolojisi nematodlar içinde çeşitli yönlerini incelemek için uzun bir soy bilim adamlarının önünü nöronal gelişim, eğitim için C. elegans kullanılmasına öncülük etmiştir. Bu soy Nobel Ödülü sahipleri Craig Mello ve Andrew Fire onların RNAi iş1için Robert Horvitz ve John Sulston organ gelişimi ve Apoptozis2,3,4onların çalışmaları için ve Martin Chalfie içerir Yeşil flüoresan protein5üzerine çalışmaları için. Bu model organizma geleneksel olarak son 15 yılda biyoloji, moleküler ve gelişimsel çalışmaya yolculuklarında uygulanmış olsa, araştırmacılar Biyoloji Pseudomonas dahil olmak üzere çeşitli insan patojenlerin araştırmak için C. elegans kullanmaya başladı aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericave Serratia marcescens6,7,8,9,10. Bu çalışmalar birçok insan-patojen etkileşimde yer alan ilgili mekanizmaların korunmuş ortaya nematodlar de, ama bu bu model organizma11,12‘ ye özgü bazı bağışıklık mekanizmaları vardır. Doğada, C. elegans tehditlerine karşı alınan patojenler toprakta mevcut çeşitli karşılaşır ve bu gelişmeye ve onun intestinal Lümen sofistike bir doğuştan gelen bağışıklık sistemi korumak için güçlü bir seçici basınç sağlamıştır. Genler ve mekanizmaları intestinal Lümen korunması dahil çoğu aynı zamanda daha yüksek memeliler11,13‘ te var son derece korunmuş öğeler tarafından düzenledi. C. elegans bu nedenle Salmonella enterica14, Shigella boydii15veya kolera16gibi gastrointestinal patojenler çalışmaya büyük bir model temsil eder.

Burada biz C. elegans olağanüstü çok yönlü C. albicansgibi enfeksiyöz ajanlar çalışmaya modeli ana bilgisayar olarak vurgulayın. C. elegans modeli ana bilgisayar olarak daha az pahalı ve zaman alıcı kandidiyazis42eğitim için yaygın olarak kullanılan bir fare modeli daha virülans için yüksek aktarım tarama sağlar.

Bu çalışmada, biz bu modeli ve assosiated hayatta kalma tahlil güvenilir ana bilgisayar doğuştan gelen bağışıklık effectors enfeksiyonlar, virülans, sürücü patojen belirleyicileri karşı koymak önemli eğitim için kullanılabileceğini gösterir ve farmakolojik olabilir maddeler ve birleşimler patogenezinde müdahale. Yukarıda açıklanan deneyleri için birbirine benzemeyen, bu yöntem maruz kalma bir patojen hayvan sadece yetişkinlik yerine, yetişkinlik larva Sahne Alanı’ndan ölüm43,44ömrünü üzerinden eğitim için bir yol sağlar. Özet olarak, bizim C. elegans – sadece sürücü enfeksiyon ve bağışıklık genetik üsleri eğitim için aynı zamanda yeni bileşenleri, terapötik müdahale için tanımlamak için kullanılan çok yönlü ve güçlü bir araç C. albicans modelidir.

Protocol

1. Yuvarlak solucanlar büyüme orta (NGM) hazırlık için 1 L medya, 20 g agar, 2.5 g organik azot kaynağı (örneğin, bacto-pepton) ve 3 g sodyum klorür bir 2 L şişesi içinde birleştirmek. 975 mL steril su ekle. Ekle bir steril heyecan barda. Bir otomatik medya dökücü, otoklav boru ve medya 15dk için kullanıyorsanız; medya-meli var olmak autoclaved için artık daha fazla yapılırsa. Ayarla medya heyecan plaka üzerinde ve soğuma…

Representative Results

C. albicans ve C. elegans kullanarak bir Patogenez tahlil (şekil 1) daha önce bizim laboratuvar17,18 ve diğer labs19,20tarafından tarif edilmiştir. C. albicans hücreleri hızlı bir şekilde solucanlar tarafından yutulur ve yavaş hareket, neden intestinal Lümen içinde birikir gösterilen C. albicans</em…

Discussion

Biz anlatmıştık C. albicans maruz ömür boyu üzerinde C. elegans enfeksiyon ve hayatta kalma raporlaması için yöntemler başka bir patojen sınamak için değiştirilebilir. Başka bir bakteri veya mantar sıvı kültürleri yapılmış ve C. elegans için benzer bir şekilde beslenir. Ayrıca, seri enfeksiyonlar denetlesinler ilk larva bir patojen için açıklandığı gibi göstererek ve sonra hayvanlar yetişkinlik ulaştıktan sonra ayrı bir patojen içeren yeni bir plaka üzerine…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser gerçekleştirilen ve Worcester Polytechnic Enstitüsü tarafından desteklenen.

Materials

Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
  3. Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
  4. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  5. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  6. Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
  7. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  8. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  9. Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
  10. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
  11. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  12. Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
  13. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
  14. Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
  15. Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
  16. Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
  17. Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
  18. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  19. Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
  20. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
  21. Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
  22. Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
  23. Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
  24. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  25. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  26. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
  27. McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
  28. Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
  29. Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
  30. Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
  31. Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
  32. Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
  33. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
  34. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
  35. Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
  36. Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetik. 176 (3), 1567-1577 (2007).
  37. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  38. Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
  39. Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
  40. Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetik. 205 (2), 559-576 (2017).
  41. Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
  42. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
  43. Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
  44. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
  45. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).

Tags

Caenorhabditis ElegansIn Vivo ModelHost-microbe InteractionsFungal InfectionPathogen VirulenceHost Immune ResponseDrug DiscoveryInfectious DiseaseBacteriaMicrobial InteractionsWorm PickingAgar ChunkingM9 BufferOP50 E. Coli

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans – A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image