Un Multimodal enfoque de imagen basados en tomografía Molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación Longitudinal de la Fibrosis pulmonar inducida por bleomicina en ratones
Summary
Describimos a un no-invasivo multimodal enfoque basado en la tomografía molecular Micro-CT y la fluorescencia para la evaluación longitudinal del modelo ratón pulmonar la fibrosis inducido por la instilación intratraqueal doble de bleomicina la proyección de imagen.
Abstract
Fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es una enfermedad pulmonar mortal caracterizada por la destrucción progresiva e irreversible de la arquitectura del pulmón, que causa un deterioro significativo en la función pulmonar y posterior muerte por insuficiencia respiratoria.
La patogenia de IPF en modelos animales experimentales ha sido inducida por la administración de bleomicina. En este estudio, investigamos un modelo IPF-como ratón inducido por una instilación de bleomicina intratraqueal doble. Las evaluaciones histológicas estándar utilizadas para el estudio de la fibrosis pulmonar son procedimientos invasivos con el terminal. El objetivo de este trabajo es controlar fibrosis pulmonar a través de técnicas no invasivas de imagen como tomografía Molecular fluorescente (FMT) y Micro-CT. Estas dos tecnologías validadas con los resultados de histología podrían representar un revolucionario acercamiento funcional para tiempo real monitoreo no invasivo de la progresión y severidad de la enfermedad IPF. La fusión de los diferentes enfoques representa un paso más para la comprensión de la enfermedad de la IPF, donde se observan los eventos moleculares que ocurren en una condición patológica con FMT y los subsecuentes cambios anatómicos pueden ser monitoreados por el Micro-CT.
Introduction
La fibrosis pulmonar idiopática (IPF) es la enfermedad pulmonar crónica con disminución progresiva de las funciones de pulmón que suele ser por desgracia fatal dentro de cuatro años de diagnóstico1. Las características principales de IPF son deposición de matriz extracelular y la proliferación de fibroblastos, pero la patogénesis no se entiende todavía completamente. La hipótesis más compatible es que múltiples ciclos de lesiones pulmonares provocan la destrucción de células epiteliales alveolares que conduce a alteración de la proliferación mesenquimal ciclo celular, la acumulación exagerada de fibroblastos y miofibroblastos, y producción de la matriz aumentada. Mediadores involucrados en estos procesos como metaloproteinasas de matriz (MMPs) se han encontrado normales en el desarrollo de fibrosis en IPF humana o en modelos animales inducido por la bleomicina. La producción de MMP incontrolada conduce a un depósito de colágeno desequilibrada dentro del intersticio del pulmón y el espacio alveolar, mímico herida anormal reparación1,2.
Uno de los principales obstáculos para el desarrollo y descubrimiento de fármacos es la disponibilidad de modelos de ratón accesible que mímico humano patogenesia y el fenotipo de la enfermedad. Diferentes agentes se han utilizado para inducir la fibrosis de pulmón en modelos animales: daño de la irradiación, administración de asbesto y sílice, la administración de citoquinas fibrinogenic y bleomicina3,4; sin embargo la bleomicina es la más utilizada en ratones, ratas, cobayas, hámsteres, conejos5 o en grandes animales (primates no humanos, caballos, perros y rumiantes)6,7. La bleomicina es un antibiótico de la bacteria Streptomyces mezcla8 y se utiliza como un agente contra el cáncer9. La fibrosis pulmonar es un efecto secundario común de la droga y por esta razón, se utiliza en modelos animales experimentales para inducir fibrosis pulmonar.
En los modelos de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina, las lesiones fibróticas ocurren 14 a 21 días después de la administración de bleomicina. En el trabajo presentado, se utilizó un nuevo protocolo para inducir fibrosis de pulmón en ratones por instilación endotraqueal de bleomicina doble. El modelo de ratón de bleomicina es muy lento porque nuevos fármacos deben evaluarse en las lesiones fibróticas establecidas y probadas para distinguir sus efectos anti-fibróticos de efectos antiinflamatorios.
Determinación bioquímica del contenido de colágeno, morfométricas y análisis histológico se basaron en análisis de post mortem, limitando la posibilidad de seguir la patogenesia de la enfermedad en el animal mismo. Aunque estos parámetros eran considerados un estándar de oro para la evaluación de fibrosis, no proporcionan ninguna distribución temporal o espacial de la lesión fibrótica y excluye una manera de investigar el proceso de progresión de la enfermedad. 10
Recientemente, se han aplicado tecnologías de proyección de imagen no invasivas para monitor remodelación vía aérea, la inflamación y la progresión de la fibrosis en modelos murinos: proyección de imagen de resonancia magnética (MRI), tomografía de computadora Micro (Micro-CT), fluorescencia Molecular Tomografía (FMT) y bioluminiscentes (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Proponemos un enfoque de proyección de imagen no invasiva para monitorear longitudinalmente progresión de fibrosis pulmonar por la FMT y Micro-CT en diferentes momentos después de que un bleomicina desafío22.
Muchos caminos están involucrados en la creación y desarrollo de fibrosis, y no se sabe mucho. Sólo una comprensión más profunda de estos procesos podría traducirse a más blancos de la droga que pueden transferir a la clínica. La capacidad para monitorear longitudinalmente activación de MMP por tomografía de fluorescencia molecular juntada a la detección de cambios parenquimatosos pulmonares por Micro-CT podría utilizarse en el futuro para acceder a la respuesta clínica al tratamiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de muchos grupos de investigación centrado en el desarrollo de nuevos fármacos para el tratamiento de IPF en el momento sólo dos están disponibles para los pacientes. Hay una necesidad médica urgente para encontrar tratamientos más eficaces7 porque sólo un pulmón transplantationis capaces de prolongar la supervivencia de 4-5 años26. La condición esencial para la medicina traslacional y el desarrollo de nuevos fármacos es la disponibilidad de un modelo ani…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer al Dr. Daniela Pompilio y Roberta Ciccimarra ayuda técnica.
Materials
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
Referenzen
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- . . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
