Мультиплекс цитокина профилирование Splenocytes стимулировали мыши с использованием платформы на базе гранулярных шарик иммуноанализа
Summary
Этот протокол описывает количественная оценка нескольких целей цитокина одновременно в supernatants культуры ткани, собранных от стимулировали мыши splenocytes bead многозальных платформы на основе иммуноферментного анализа и проточный цитометр.
Abstract
На основе бисера иммуноанализа используют тот же основной принцип как сэндвич иммуноанализа. Захват бусы, которые могут быть продифференцированы по размеру и интенсивности флуоресценции внутренней аллофикоцианин (APC), являются конъюгированных антител специфических для конкретного исследуемое вещество. Далее выбранной группы захвата определенных бисера наборы инкубировали с биологической пробы, содержащей целевой аналитов специфичные для захвата антител. Добавляется биотинилированным обнаружения антител коктейль, который приводит к образованию захвата шарик-исследуемое вещество обнаружение антител бутерброды.
Наконец добавляется стрептавидина фикоэритрин (SA-PE), которая связывает биотинилированным обнаружения антител, обеспечивая интенсивностью флуоресцентного сигнала пропорционально количество связанных исследуемое вещество. PE флуоресцентного сигнала бусины аналита конкретных регионов количественно с помощью проточной цитометрии и концентрации конкретных аналитов определяются с помощью программного обеспечения для анализа данных и калибровочной кривой, созданный в assay.
В этом эксперименте мы используем мышь T вспомогательный цитокина панели одновременно определить концентрацию 13 целей отдельных цитокинов в supernatants культуры ткани, собранных от мыши splenocytes культивировали в различных условиях стимулирующее.
Introduction
В их роли как растворимые сигнальных молекул цитокины посредником высоко скоординированных и многофакторных процессов, которые управляют хост иммунологических реакций. Они выражаются на всех стадиях воспалительного процесса, от начала к резолюции и регулируют сложного взаимодействия сети, которая включает в себя их собственные синтеза и что их клеточных рецепторов1. Эта сеть связи слоистых с сложности, которая выходит за рамки синергетические и антагонистические отношения, которые могут существовать между отдельными компонентами. Действительно многие цитокинов известны поделиться излишними или по крайней мере частично перекрывающихся функций2,3.
Интегрированные системы биологии подходы, которые одновременно определить несколько цитокина аналитов в настоящее время оказывают все более полное понимание уникальной cytokinomes, что оркестровать иммунных реакций, лежащих в основе несколько заболеваний государства4,5. Эти болезни государств варьируются от обобщенных воспаление рака, нейро дегенеративных условиях и сердечно-сосудистых заболеваний6,,78,9.
Такие цитокиновой сети могут быть допрошены эффективно с помощью LEGENDplex на основе бисера иммуноанализа. Эти анализы основаны на том же принципе как сэндвич твердофазный Assay иммуносорбента (ELISA) и использовать флуоресценции кодировке микросфер с захвата антитела ковалентно прилагается к их поверхности. Эти антитела иммобилизованных на площади поверхности гораздо меньше, чем те, которые требуются от традиционных форматов ELISA. Это позволяет такие анализы выполняться с гораздо меньше объема выборки, хотя в то же время снижение неспецифической привязки и обеспечивая мультиплексированных анализ нескольких аналитов.
Assay, указанных в настоящем Протоколе использует эту технологию для quantitate до 13 целей одновременно. Данные из этого анализа можно получить, используя широкий спектр общедоступных потока цитофлуориметрами и в отличие от других имеющихся анализов не требует использования выделенных пробирного конкретных приборов. С расширение каталог проверенных аналита панелей эти анализы были использованы в нескольких текущих биомедицинских исследовательских проектов10,11,12,13.
Чтобы продемонстрировать легкость и полезность анализа формата, в этом эксперименте мы используем панель цитокина вспомогательный мыши T чтобы quantitate 13 отдельных концентрации цитокинов от supernatants культуры ткани, полученные от мыши splenocytes культивированный под несколькими стимулирующие условия. В дополнение к supernatants культуры ткани этот assay также может выполняться с использованием образцов сыворотки или плазмы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пробирного формат, описанный в настоящем Протоколе может обеспечить надежной количественной оценки растворимых посредника профилей в биологических образцах, предоставляемых экспериментатор имеет надлежащей лабораторной техники и придерживается рекомендуемый протокол.
Есть несколько ключевых шагов, которые необходимо соблюдать, с тем чтобы гарантировать надежные результаты. Во-первых рекомбинантных стандартов должно быть разрешено в буфере пробирного полный время рекомендовал, и после того, как только разводят в полипропиленовые трубы. Полистирольные трубы могут содействовать присоединению белков к стенке трубы, которые могут привести к низким сигналов при генерации калибровочной кривой. Во-вторых, надлежащего пожимая во время инкубации шаги имеет решающее значение. Без надлежащего агитации можно серьезно препятствуют характеристики привязки пробирного бусины. Кроме того требуется также надлежащее Стиральная между шагов инкубации. Экспериментатор необходимо убедиться, что избыток реагентов удаляются из скважин до начала следующий шаг в протоколе. Также должны быть оптимизированы параметры инструментов для проточный цитометр допроса пробирного бусины. В частности PMT параметры должны быть скорректированы для обеспечения надлежащего шарик разделения и широкий динамический диапазоны для стандартных кривых. Наконец просто до анализируются на цитометр, бусины должны быть vortexed для обеспечения надлежащего подвеска и во избежание формирования агрегатов, которые могут исказить результаты.
Этот протокол потенциально может быть изменен для анализа гомогенатах ткани, а также типы образца, обсуждается в этой рукописи, условии исследователь хочет оптимизировать их лизис протокол до выполнения анализов большой, полную тарелку. Фактический метод будет варьироваться в зависимости от типа ткани; Однако в общем протоколе следует использовать нейтральный pH буфер, содержащий физиологические концентрации ионных солей, не денатурируя химических веществ и желательно без моющих средств. Если необходимо использовать моющее средство, не ионных концентраций детергентов должны храниться как минимум (например не более 1%). Буфер должен также содержать достаточную ингибиторы протеазы для предотвращения протеолитических деградации белков-мишеней. Независимо от того, используемый протокол лизиса окончательной подготовки следует центрифугировали для удаления частиц до анализа.
Что касается анализа ограничения концентрации аналита целей в биологических образцов типов может сильно различаться. Для того, чтобы правильно измерить концентрации аналита, они должны находиться в верхней и нижней значения для стандартной кривой. Экстраполяция значений кривой надежен не обязательно и не рекомендуется. Поэтому следователи необходимо оптимизировать разбавления их конкретных образцов в пилотных экспериментов перед запуском пробирного полный пластины. Кроме того тщательная подготовка биологических образцов для быть assayed имеет первостепенное значение для успеха этого анализа формата. Образцы, которые являются lipemic, опаковые или содержат белок мусора будет влиять на взаимодействий антиген антитела, которые определяют основной принцип этой иммуноанализа и визуализации результатов, которые являются нечитаемое.
Этот assay имеет важное значение в отношении существующих методов количественной оценки по нескольким причинам. При правильной, пробирного формат может quantitate до 13 аналитов от образца, используя намного меньшие объемы чем необходимо будет анализировать образец, используя традиционные assays ELISA. Этот assay формат также не требует специального инструментария для того, чтобы быть выполнена. Это преимущество по сравнению с другими коммерчески доступных на основе бисера иммуноанализа как assay может выполняться с использованием любое количество часто используемых потока цитофлуориметрами.
Научные расследования роль играют секретируемые факторов и цитокина сетей в области здравоохранения и болезни расширяется. Пробирного формат, описанный в этой рукописи может быть ценным инструментом для исследователей, стремящихся понять этих многоплановых и сложных явлений. Активные биомедицинских исследовательских программ начинают изучать роль цитокинов сетей не только областей таких как обобщенные воспаление6, но и в контексте конкретных заболеваний государств, таких как атеросклероз, рак и neuroinflammation 15,16,17. Несомненно расследование будет продолжать расти в таких областях, как поиск Роман терапии для лечения этих хронических расширяет. Потребность в точной и надежной количественной оценки растворимых медиаторов, связанных с этими заболеваниями будет оставаться приоритетной критических исследований.
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы признать вклад биомаркеров и иммуно анализов команды разработчиков продукта на развитие assay. Кроме того мы хотели бы поблагодарить Vigene Tech, Inc. за их совместные усилия в разработке пакетов программного обеспечения анализа данных.
Materials
| Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
| Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
| Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
| Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
| Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
| Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
| FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
| Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
| Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
| 96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Referenzen
- Stanley, A. C., Lacy, P. Pathways for cytokine secretion. Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).
- Nicola, N. A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor. Stem Cells. 12, (1994).
- Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).
- Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. Human Cytokinome: a new challenge for systems biology. Bioinformation. 5, 166-167 (2010).
- Capone, F., et al. Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays. Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).
- Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy. Nat Med. 19, 822-824 (2013).
- Tse, E., Kwong, Y. L. T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers. Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).
- Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).
- Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. Multiple cytokine biomarkers in heart failure. Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).
- Gobel, K., et al. Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells. Nat Commun. 7, 11626 (2016).
- Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity. Sci Rep. 6, 27687 (2016).
- Yu, Y., et al. The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development. J Exp Med. 212, 865-874 (2015).
- Pelly, V. S., et al. IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection. Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).
- . LEGENDplex Multiplex Assays Available from: https://www.biolegend.com/legendplex (2017)
- Autieri, M. Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis. ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).
- West, N. R., et al. Emerging cytokine networks in colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).
- Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).
