Cytokine Profiling Immunoassay Cytometric 구슬-기반 플랫폼을 사용 하 여 자극된 마우스 Splenocytes의 다중화

모든 동물 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 포함 된 NIH 권장 사항에 따라 수행 하 고 BioLegend에 IACUC에 의해 승인 했다. 그림 1: 필터 플레이트 분석 결과 절차 요약. 필터 플레이트를 사용 하 여 분석 결과 수행 하기 위한 프로토콜 분석 결과 주요 구성 요소와 인큐베이션 단계를 묘사한 다이어그램으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 1. 생물학 견본 준비 참고: 선택한 해 부 사이트와 혈액 컬렉션의 볼륨은 각 개별 수 사관의 재량에 왼쪽과 분석 결과의 결과는 영향을 미치지 것입니다. 그러나, 그들은 얻을 수 있습니다, 일단 샘플 처리 아래에 나열 된 단계에 따라. 혈 청 샘플의 준비 원하는 양의 기본 컬렉션 튜브에 혈액을 수집 하 고 적어도 30 분에 대 한 응고 샘플 실 온에서 1000 x g에서 10 분 원심. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 혈 청 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 ≤-20 ° c. 플라즈마 샘플 준비 혈액 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 사용 하 여 원하는 양의 혈액 컬렉션 튜브를 코팅 하는 수집. 컬렉션의 실내 온도 30 분 이내에 1000 x g에서 10 분 원심 분리기. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 플라즈마와 분석 결과 즉시, 또는 약 수를 제거 하 고 저장에서 샘플 ≤-20 ° c. 조직 문화 표면에 뜨는 샘플의 준비 샘플 셀 및 파편 제거 하 4 ° C에서 1500 x g에서 10 분 원심. 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브로 상쾌한 및 분석 결과 즉시 또는 약 수를 수집 하 고 저장 ≤-20 ° c. 녹고 냉동 생물 샘플의 완전히 녹여 얼음, 그리고 사용의 앞에 짧게 소용돌이에 모든 이전 냉동된 생물 학적 샘플. 2 개 이상의 동결/해 동 주기를 방지. 참고:이 프로토콜에 사용 되는 샘플 BALB/c 마우스 splenocytes를 경작 하 여 얻은 했다 (37 ° C + 5% CO 2 다양 한 조건에서 1 x 10 6 셀: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µ g/mL 플레이트 코팅) + αCD28 (1 µ g/mL 녹는), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). 문화 supernatants 48 h 후 수집 된 고 1.3 섹션에서 설명한 대로. 2. 시 약 준비 Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized 구슬 Sonicate 미리 혼합된 구슬 병 실 온에 30 s 이전 사용에 대 한 다음 소용돌이 sonicator 목욕에서 1 분. Sonicator 목욕을 사용할 수 있는 경우와 동 시간 1 분을 증가 준비의 워시 버퍼 가져와 20 x 워시 버퍼 (1 x PBS 트윈-20) 실내 온도와 솔루션으로 모든 염 려 소용돌이 키트와 함께 제공 된. 475 mL 이온된 물으로 워시 버퍼 x 20의 25 mL를 희석. 2 ° C와 1 달까지를 위한 8 ° C 사이 저장소 사용 하지 않는 부분. 매트릭스 B 준비 (사용을 위해 혈 청 및 혈장 샘플만) 분석 결과 버퍼 (1 %BSA PBS)의 완전 한 reconst에 대 한 동결 건조 된 매트릭스 B. 허용 최소 15 분을 포함 하는 병을 키트에 포함 된 5.0 mL를 추가 itution, 다음 잘 섞어 소용돌이 남은 재구성된 매트릭스 B에 저장 될 수 있다 ≤-70 ° C 까지의 한 달. 3. 표준 준비 참고:이 패널에서 각 분석은 10000 pg/mL의 최고 표준 농도. 추가 250 µ L는 동결 건조 된 마우스 일 Cytokine 표준 칵테일 다시 구성할 분석 결과 버퍼의 . 짧게 vortexing에 의해 혼합 고 10 분 동안 실내 온도에 앉아 유리병 전송 표준 칵테일 표시 된 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브 " C7 ". 상위 표준으로 사용 됩니다. C6, C5, C4, c 3, C2, 및 c 1으로 라벨 6 폴 리 프로필 렌 microcentrifuge 튜브. 이러한 튜브의 각 분석 결과 버퍼의 추가 75 µ L. 전송 25 µ L의 C6 튜브를 vortexing에 의해 잘 믹스 최고 표준 C7. 이 C6 표준 될 것입니다. 직렬 수행 계속 새로운 피펫으로 사용 하 여 1:4 희석 기준 C5, C4, c 3를 이전 표준의 25 µ L 다음 가장 낮은 표준 튜브 vortexing 뒤에 분석 결과 버퍼의 75 µ L에 추가할 각 튜브에 대 한 팁 C2, 및 C1. 분석 결과 버퍼를 사용 하 여 0 pg/mL의 표준 (C0). 4. 샘플 희석 참고:이 분석 결과 사용 하 여 여러 희석과 예비 파일럿 실험 생물 샘플의 특정 집합에 대 한 가장 적절 한 희석 비율을 결정 하는 데 필요한 수 있습니다. 적절 한 희석 요소 농도 계산 샘플에 대 한 표준 곡선의 범위 내에서 거짓말을 생산할 예정 이다. 다음 단계 지침으로 의미 되 고 샘플 유형에 따라 실험적으로 결정 되어야 할 수 있습니다. Dilute 혈 청 또는 플라스마 2-fold 샘플 분석 결과 버퍼 (예. 50 µ L의 샘플 분석 결과 버퍼의 50 µ L로 희석) microcentrifuge 폴 리 프로필 렌 튜브에. 참고: 추가 샘플 희석 해야 하는 경우 희석 할 수 매트릭스 b 정확 하 게 측정 하도록 분석 결과 버퍼 대신. 희석 하지 않고 추가 혈 청 또는 혈장 샘플 분석 결과 낮은 정확도 되며 필터 플레이트를 방해할 수 있습니다. 매트릭스 B는 풀링된 마우스 혈 청 내 생 분석 결과 대상의 고갈로 구성 됩니다. 그것 immunoassays의 영향 분석 감도에 알려져 있습니다 매트릭스 효과 피하기 위해 혈 청 또는 혈장 샘플 희석제로 사용 됩니다. 테스트 셀 희석 하지 않고 문화 표면에 뜨는 샘플. 참고: 분석의 수준 샘플 샘플에서 크게 달라질 수 있습니다. 필요한 경우 해당 세포 배양 매체 또는 분석 결과 버퍼의 신선한 준비를 사용 하 여 표면에 뜨는 샘플 희석. 5. 시험의 절차 참고: 폴 리 프로필 렌 필터, 마이크로 FACS 튜브, 또는 V 아래 microplates에서 분석 결과 수행할 수 있습니다. 필터 플레이트 분석 결과 절차 일관성, 분석 결과 견고성 및 취급의 용이성 때문에 좋은 샘플 샘플 좋습니다. 이 절차 (최종 사용자가 제공)에 진공 여과 장치를 필요로. 따뜻한 실내 온도 (20-25 ° C) 모든 시 약을 사용 하기 전에 허용. 거꾸로 플레이트 커버에 필터 플레이트 항상 분석 결과 설치 및 인큐베이션 단계는 플레이트의 하단 만지지 않는다 어떤 표면 든 지 그것은 누수를 일으킬 수 있도록 세트. 구슬 유실을 방지 세척 단계를 포함 하 여 전체 분석 결과 절차 동안 접시를 똑바로 유지. 어두운 또는 모든 인큐베이션 단계에 대 한 알루미늄 호 일 포장에 접시를 유지. 순차적 순서로 접시에 배열 하는 중복으로 모든 표준 및 샘플을 실행. 미리 각 우물에 워시 버퍼 x 1의 100 µ L을 추가 하 여 필터 플레이트를 젖은 및 (해당 되는 경우 사용 하는 필터-하단 microplate) 실 온에서 1 분 동안 앉아 보자. 진공 매니폴드 (5-10 s)를 사용 하 여 제거 버퍼 볼륨. 10을 초과 하지 마십시오 " Hg 진공의. 오 점 초과 워시 깨끗 한 종이 수건의 스택에 접시를 눌러 접시의 아래쪽에서 버퍼. 거꾸로 플레이트 커버 위에 접시를 놓습니다. 참고: V-하단 microplate 또는 마이크로 FACS 튜브를 사용 하 여 분석 결과 수행 하는 경우 생략 될 수 있습니다 단계 5.1-5.2. 셀 문화 표면에 뜨는 샘플에 대 한 추가 분석 결과 버퍼의 25 µ L 모든 우물. 표준 우물에 각 표준의 25 µ L를 추가 합니다. 각 샘플의 25 µ L 샘플 우물을 추가. 혈 청 또는 혈장 샘플을 측정, 표준 우물을 행렬 B의 25 µ L을 추가. 샘플 우물에 분석 결과 버퍼의 25 µ L를 추가 합니다. 표준 우물에 각 표준의 25 µ L를 추가 합니다. 각 희석된 혈 청 또는 혈장 샘플의 25 µ L 샘플 우물을 추가. 소용돌이 구슬 구슬 정착 하지 않으려면 일시적으로 구슬 병을 흔들어 각 잘 혼합된 구슬의 30 s. 추가 25 µ L에 대 한 혼합. 마지막 볼륨 구슬의 추가 후 75 µ L에 각 잘 되어야 합니다. 접시 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시를 바꿈. 판 통에 접시를 놓고, 보안 및 실 온에서 2 h에 대 한 약 500 rpm에서 흔들어. 누수를 방지 하려면에 적용 되지 않는 긍정적인 압력 판 마감재. 반전, 없이 접시에 진공 매니폴드 및 이전과 진공을 적용 놓고 각 잘 워시 버퍼 x 1의 200 µ L 추가. 진공 여과 분석 결과 격판덮개 우물의 내용을 제거합니다. 오 점 흡수 성 패드 또는 종이 수건을 가진 격판덮개의 바닥에서 과잉 워시 버퍼. 이 단계를 한 번 더 반복. 참고: 분석 결과 수행 하는 경우 건너뛰기 단계 5.12 및 5.13 튜브 V 하단 microplate 또는 마이크로 FACS를 사용 하 여 합니다. 대신 실 온에서 5 분 동안 1000 x g에서 격판덮개 원심 다음 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 제거. 탐지 항 체 (재료의 표 참조)를 각 잘의 추가 25 µ L. 신선한 플레이트 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시 포장. 판 통에 접시를 놓고 실 온에서 1 시간에 약 500 rpm 동요. 진공 청소기, 없이 각 우물에 직접 25 µ L SA PE 시 약의 추가. 없음 희석 시 약의 필요 하다. 신선한 플레이트 마감재와 접시를 봉인. 거꾸로 플레이트 커버, 알루미늄 호 일을 포함 하 여 전체 접시 포장. 판 통에 접시를 놓고 실 온에서 30 분 동안 약 500 rpm 동요. 반복 단계 위의 5.13. 워시 버퍼 각 x 1의 추가 200 µ L 음. 다시 1 분에 대 한 접시 통에 구슬 중단 샘플을 필터 플레이트에서 교류 cytometer에 샘플을 읽을 FACS 튜브 전송 다채널 피펫으로 사용 하 여,. 참고: 샘플 볼륨 증가 200 µ L에서 300 µ L에 건조를 실행 하는 샘플을 피하기 위해 각 튜브를 워시 버퍼 x 1의 추가 100 µ L을 추가 하 여. 필요한 샘플에 저장 될 수 있습니다 4 ° C 빛에서 보호 하 고 다음 날 분석. 그러나, 장기간된 샘플 저장 감소 된 신호를 발생할 수 있습니다. 6. Flow Cytometer 설정 참고: 신뢰할 수 있는 데이터를 생성 하기 위해 교류 cytometer 설정 해야 합니다 제대로 데이터 수집 전에. 이 과정에 일부 분석 결과에 수행 하는 특정 악기의 구성에 따라 개별 사용자에 대 한 달라질 수 있습니다. PE와 APC를 측정할 수 및 둘 다 갖춘 cytometer에 대 한 일반적인된 설치 과정 488 고 633 nm 레이저 아래 설명. 흐름 cytometer 및 수집 소프트웨어는 제조 업체에 따라 시동 ' 악기와 함께 제공 된 s 지침. 만들기 점 x 축 및 y 축에 대 한 SSC (사이드 분산형) FSC (앞으로 분산형)와 음모. FSC 그리고 SSC를 선형 모드로 설정. Y 축 x 축과 APC에 PE와 함께 두 번째 점 음모를 만듭니다. 이 음모는 로그 기반 디스플레이 모드를 설정 해야 합니다. 소용돌이 30 키트에 포함 된 원시 구슬의 유리병 다시 구슬을 일시 중단 하는 s. 이 구슬 내부 APC 염료를 포함 하 고 두 크기 인구의 구성. 새 FACS 튜브를 원시 구슬의 전송 400 µ L. 낮은 교류 cytometer 유량 설정. 원시 구슬, 신중 하 게 조정 이득 및 전압 FSC 그리고 SSC는이 구슬의 크기 인구 두 가시 분리 하 고 게이트를 쉽게 실행. 원치 않는 이벤트 (예: 파편 또는 공기 거품)를 제외 하는 FSC 임계값 조정. SSC 대 FSC에 음모, 그리는 모든 비드 인구를 포함 하는 문. 참고: 원시 구슬 포함 구슬의 두 개의 크기 인구 더 작은 "는 구슬 " 및 큰 " B 구슬 " 지역. Y 축 x 축과 APC에 PE와 함께 두 번째 점 플롯에 FSC 대 SSC 줄거리에서 문이 비드 인구 표시. 송출 신호 모든 인구를 구슬에 1 x 10 1와 5 x 10 3 사이 중간 형광 강도 (MFI) APC 형광 채널 PMT 전압 조정. 소용돌이 PE 설치의 유리병 30 비즈 구슬 다시 중단 s. 새 FACS 관에 PE의 전송 400 µ L 비즈. 바꾸기 원시 구슬 PE와 교류 cytometer에서 튜브 튜브 비즈. PE 구슬 유리병에 표시는 PE 형광 채널 설정 있도록 PE 구슬의 MFI 폭포 발견 많은 특정 범위 사이의 광 전 증폭 관 관 (PMT) 전압 조정. 참고: PE 설치 구슬 포함 한 인구 크기의 구슬 ("는 구슬 "만). 7. 데이터 수집 참고: 특정된 악기에 대 한 데이터의 수집와 관련 된 정확한 절차 다를 수 있습니다 고는 cytometer에 ' s 구성 사양 및 사용 하는 인터페이스 소프트웨어. 아래의 지침 따라서 cytometer 분석 결과 관계 없이 분석 결과에 주의가 필요한 단계를 강조 하기 위한 것. Cytometer 유량 설정 아직 확인을. 약 300 실정이 획득 구슬 이벤트의 수를 설정 합니다. 13-플렉스에 대 한이 3900 이벤트 습득에 상당 하는 패널 두 구슬 크기 인구 (A + B 구슬)에서 결합. 소용돌이 5 각 샘플 분석 하기 전에 s. 읽기 샘플입니다. 샘플을 읽을 때 먼저 교류 cytometer 설치 모드를 설정 하 고 비드 인구 수집 모드로 전환 하기 전에 안정화 될 때까지 기다립니다. 간단한 이름을 데이터 파일에 대 한 연속 번호와 함께 사용 하 여 데이터 분석을 용이 하 게. 총 이벤트 보다 (A + B 구슬 지역) 문이 이벤트만 내보냅니다. 각 분석 결과 대 한 동일한 폴더에 모든 FCS 파일을 저장합니다. 여러 분석 실험을 실행 하는 경우 각 분석 결과 대 한 별도 폴더를 만듭니다.

8. 데이터 분석 진행 참고: 교류 cytometer에서 생성 되는 FCS 파일 다운로드 받을 수 있는 무료 14 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 해야 합니다. 데이터 분석 소프트웨어는 PC에 설치. 분석 소프트웨어를 포함 하는 컴퓨터에 모든 시험 FCS 파일 전송. 컴퓨터의 USB 포트에 꽂습니다 (키트에 포함) 라이센스 키 동글. 데이터 분석 소프트웨어 출시. 파란색을 클릭 " 파일 추가 " 버튼 화면의 상단에 있는. 팝업 표시 되는 창에에서 분석 결과에서 FCS 파일이 들어 있는 폴더를 탐색. 클릭 소프트웨어 디스플레이 팝업 창에서에서 모든 분석 결과 FCS 파일을 드래그. 모든 파일을 목록에 이제 나타납니다. 클릭 녹색 " 다음 " 디스플레이의 오른쪽 하단에 있는 버튼. 작은 드래그를 누르고 클릭 블루 표준 곡선 표준 곡선을 정의 하 고 목록에서 해당 FCS 파일 (C0에 C7) 버튼. 녹색을 클릭 " 다음 " 제어 팝업 창이 열 디스플레이의 오른쪽 하단에 버튼. 제어 윈도우의 왼쪽에 A의 이름을 입력 하 고 B 비드 지역 분석 결과 분석 대상과 (분석 결과 함께 제공 된 설명서에서 발견 되는) 그들의 관련 된 비드 ID 오름차순. 팝업 창 상단에서 제어 도구를 선택 하 고 금감위 대 SSC 음모에 2 문, A 구슬 주위 1와 B 구슬 주위 그릴 사용. 는 APC 대 PE 점도 나타나는 FSC 대 SSC 음모 아래 표시를 검토 합니다. A 구슬 (왼쪽된 그림)에서 6 실정이 밴드와 7 실정이 밴드 B 구슬 (오른쪽 그림)에 있을 것입니다. 참고: 게이츠 상단에 지우개 도구를 선택 하 고 주어진된 문 삭제를 클릭 하 여 수동으로 다시 수 있습니다. 제어 도구 수 있습니다 다음 선택 하 고 수동으로 원하는 밴드 영역에는 게이트를 적용 하는 데 사용. 녹색을 클릭 " 확인 " 버튼 제어 팝업 창 닫고 FCS 파일의 목록으로 돌아갑니다. 정의 오른쪽 클릭 하면 지정 된 파일을, 선택 하 여 생물 학적 샘플으로 만들어진 모든 희석 " 희석 배 " 메뉴를 입력 올바른 값. 녹색을 클릭 " 실행 " 분석 결과 대 한 표준 곡선을 생성 하 고 알 수 없는 생물학 샘플의 농도 계산 하는 디스플레이의 오른쪽 하단에 버튼.