人类的过表达和纯化<em>顺</emβ-肾上腺素转移酶<em>大肠杆菌</em
Summary
来自大肠杆菌的非变性条件下用于过表达和纯化密码子优化的人顺式 –丙烯基转移酶的简单方案 大肠杆菌 ，以及酶活性测定法。该方案可以推广用于生产适合于机械研究的数量和质量的其它顺式异戊烯基转移酶蛋白质。
Abstract
丙二酰转移酶（PT）是一组通过多次缩合反应使用异戊烯基二磷酸酯（IPP）催化烯丙基二磷酸的链延长的酶。 DHDDS（脱氢二酰基二磷酸合成酶）是通过与异戊烯基二磷酸酯（IPP）的多次缩合催化法呢二磷酸（FPP，一种烯丙基二磷酸酯）催化链延长的真核长链顺式 -PT（从缩合反应形成顺式双键）。 DHDDS具有生物医学重要性，因为酶中的非保守突变（K42E）导致色素性视网膜炎 ，最终导致失明。因此，本协议是为了获得大量纯化的DHDDS而开发的，适用于机械研究。在这里，蛋白质融合的使用，优化的培养条件和密码子优化被用于允许功能活跃的人类DHDDS的过表达和纯化<e米>电子。大肠杆菌描述的协议是简单，成本效益和时间节省。不同物种中顺式 -PT的同源性表明，该方案也可以应用于其他真核的顺式 -PT，如涉及天然橡胶合成的那些。
Introduction
异戊二烯基转移是一组催化经由多个缩合反应1使用异戊烯二磷酸（IPP）2烯丙基二磷酸，的链延长酶。 Z型酶催化从缩合反应形成顺式双键，而E型酶催化反式双键形成3 。 顺式 –磷酸转移酶（ 顺式 -PT，Z型酶）根据其产物链长度经常分类为短链（C 15 ），中链（C 50-55 ）和长链（C 70-120 ） 4 。 DHDDS（脱氢二酰基二磷酸合成酶）是一种真核长链顺式 -PT，它通过与异戊烯基二磷酸（IPP） 1的多次缩合催化法呢基二磷酸（FPP，烯丙基二磷酸）的链延长，5，6。这导致脱氢二酰基二磷酸盐的形成，C 55-100多聚丙烯酰二磷酸酯作为焦磷酸二酰基焦磷酸酯的前体，参与N-连接蛋白糖基化的糖基载体分子1 。其中德系犹太人，在DHDDS导致常染色体隐性色素性视网膜炎7,8的错义非保守突变（K42E）。因此，本方案是为了获得适用于机械研究的纯化DHDDS而开发的。
大肠杆菌被认为是重要蛋白质表达最方便和最具成本效益的宿主，因此也是最常用的宿主。然而，当试图在大肠杆菌中异源过表达蛋白质时，应该考虑蛋白质特异性的考虑。获得正确的折叠，活动来自大肠杆菌的重组蛋白质不是由于不同蛋白质的不同特性而简单的。已经开发了许多方法来克服这些障碍。在这里，蛋白质融合的使用，优化的培养条件和密码子优化被用于允许功能活跃的人DHDDS在大肠杆菌中的过表达和纯化。值得注意的是，以前尝试过度表达酵母顺式 -PT而没有蛋白质融合，因为即使在洗涤剂12的存在下也完全不溶，因此不成功。所述方案简单，经济有效，节省时间，并允许获得适合机械研究的DHDDS制剂。鉴于不同物种中顺式 -PT的同源性，我们建议该方案也可以应用于其他真核的顺式 -PT。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的用于纯化大肠杆菌细胞中功能性人DHDDS的方案是简单和有效的，允许一旦合适的构建体可用，在3-4天内过表达和纯化蛋白质。鉴于基因组测序的突破，蛋白质纯化的这些方案具有特殊的意义，这提供了许多关于许多疾病18遗传学的信息，因此需要开发高通量方法来表征蛋白质级19的致病机制。
为了克服异源蛋白过表达和纯?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由以色列科学基金会结构细胞生物学研究中心（I-CORE）（1775/12）和以色列科学基金会资助，授予1721/16和2338/16（YH）和825/14（DK ）。对“田园遗产基金会”的支持表示高度赞赏。这项工作由Ilan Edri和Michal Goldenberg完成，部分履行了特拉维夫大学萨克勒医学院的MD论文要求。
Materials
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
Referenzen
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O’Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
