단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

모든 절차는 그라츠의 의학 대학 (12/13 전 25-240)의 윤리 위원회에 의해 승인 되었습니다. 급상승 실험에 대 한 말 초 혈액은 건강 한 개인에서 샘플링 했다. 참고:이 프로토콜은 HT-29 셀 (인간 결 장 암 세포 선) PBS 또는 HT-29 세포와 말 초 혈액의 인공적인 혼합물에서의 격리를 설명합니다. 같은 실험 두 추가 셀 라인 (LNCaP 및 VCaP, 대표 결과에 실험 데이터) 수행 하 고 이론적으로 EpCAM을 표현 하는 모든 셀 수행할 수 있습니다. 1입니다. 대상 셀의 준비 세포 배양 및 세포의 라벨참고:이 프로토콜에서 셀 교양 75 ² 문화 플라스 크에. 적절히 조정 하십시오 시 약의 양을 다른 셀 문화 장치를 사용 하는 경우 (예: 25 ² 문화 요리, 6 잘 플레이트 등). 사용 하는 모든 액체는 미리 물 욕조에 37 ° C로 예 열. 그렇지 않으면 표시 되지 않습니다, 모든 프로토콜 단계 실 온 (RT)에서 수행 됩니다. 맥 코이 5a 수정 매체 2 mM L-글루타민, 20 mM Hepes, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 5% CO2 분위기에서 37 ° C에서 1% 페니실린/스 보충에 문화 HT-29 셀. 셀 90% 합칠 때, 매체를 제거 하 고 씻어 1 x PBS의 10 mL와 함께 셀. 세포를 수확 하는 셀에 셀 분리 솔루션 (테이블의 재료 및 시 약)의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° c.에서 약 5 분에 대 한 셀을 품 어참고: 분리 솔루션 포함 분해 및 PBS, 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 그리고 3 mg/L 페 놀 레드 x 1에 collagenolytic 효소. 이 하지 활성화 됩니다 후 37 ° c.에서 1 h로 최소 세포 분리 솔루션의 미리 데우는 시간을 줄일 최적의 세포 분리를 전체 셀 레이어 커버. 거꾸로 현미경을 사용 하 여 셀의 분리를 확인 합니다. 모든 분리 된 세포의 세포 배양 매체 (동일 단계 1.1.1에서에서 사용 합니다.) 10 mL와 prefilled 50 mL 튜브에 전송 하 고 pipetting으로 세포를 resuspend. RT에서 수평 롤러 믹서에 나머지 세포 현 탁 액을 놓고 라벨 단계를 진행 합니다. 대상 셀의 셀 라벨 라이브 1 x PBS의 1 mL에 5 m m CFSE (디 메 틸 sulfoxide, DMSO에에서 제공)의 희석 1 µ L 5 µ M 준비-사용 CFSE 라벨 솔루션을 37 ° C에서 미리 예 열.참고: 최적의 착 결과 사용 하 여 갓된 솔루션. 한 준비-사용 DNA 얼룩 솔루션 (테이블의 재료 및 시 약) 1 x PBS에 준비 하 고 빛 으로부터 보호 하는 2-6 ° C에서 그것을 저장.참고: 최적의 착 결과 사용 하 여 갓된 솔루션. 가로 롤러 믹서 (단계 1.1.6.)에서 세포와 펠 릿 10 분에 대 한 300 x g 에서 셀 제거는 상쾌한 고 resuspend 1 x PBS의 10 mL에 셀. 1 x PBS로 세포를 헹 구 고 500 µ L 준비-사용 CFSE 라벨 솔루션에서 셀 펠 릿 resuspend. 15 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어 고 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리 후 세포를 수집 합니다. 미리 데워 진된 세포 배양 매체의 1 mL에 이라는 셀 resuspend 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 재생성 세포 허용. 3 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 하 고 10 분 동안 37 ° C에서 솔루션 얼룩 준비-사용 DNA의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend. 작은 셀는 상쾌한을 제거 하 고 resuspend 1 x PBS의 4 mL에 셀. 셀 밀도 hemocytometer를 사용 하 여 평가 하 고 ‘ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 및 fluorescein isothiocyanate (FITC) 필터 (그림 2A 및 2E) 장착 된 형광 형광 현미경을 사용 하 여 라벨을 확인. 300 x g 3 분에 세포를 원심 하 고 섹션에 얼음에 주어진 각 실험에 필요한 세포 밀도 따라 셀 펠 릿 resuspend. 2. 충전 와이어 참고: 셀 대상 셀/주변 혈액 spikings 밀리 리터 규모 또는 microliter 눈금에서 셀의 낮은 수를 제공 하 여 격리 수 있습니다. 반면 전 접근 허용 주변 혈액에서 드문 셀 상태를 흉내 낸, 후자 수 있습니다 프로토콜 최적화/테스트 목적을 위해 몇 가지 세포를 연결할 좋습니다. 세포 현 탁 액의 큰 볼륨을 사용 하 여 와이어를 충전 1 x PBS (휴대폰 문화 사용) 40 mL에 BSA의 0.8 g을 용 해 하 여 솔루션을 차단 2 %BSA 준비 합니다. 초기 vortexing 및 10-20 분에 대 한 수평 롤러 믹서에 RT에서 후속 인큐베이션 BSA를 분해. 린스 빈 EDTA 튜브/나트륨 덤플링 튜브 항 응 혈 약 잔류물을 제거 하 고 솔루션을 삭제 하려면 2 %BSA 2 mL와 함께. 30 분 동안 15 rpm에서 수평 롤러 믹서에 2 %BSA 5 mL와 RT에 외피에 의해 튜브 표면을 차단 하 고 솔루션을 삭제. 이라는 셀 (섹션 1.2.) 100 000 셀/mL의 농도 묽 게 하십시오 그리고 5 mL를 사용 하 여 와이어를 충전. 튜브를 이라는 세포 현 탁 액 (총에서 500 000 셀)의 5 mL를 추가 합니다. 세포 현 탁 액을 추가할 때 거품을 하지 마십시오. 와이어를 잡고 고무 캡으로 저장 격실에서 와이어를 제거 하 고 1 x PBS (그림 3)에 그것을 씻어. 주사기 바늘 (20 G)의 도움으로 EDTA 튜브 (단계 2.1.4.)의 고무 튜브 캡을 관통 하 고 놓으면 뚜껑은 튜브와 튜브에 다시 기울어진된 롤러 믹서에 기능적인 부분 세포 현 탁 액에 완전히 몰입 하는 와이어를 삽입.참고: 와이어의 트리플 헬리컬 기능 부분 충전에 걸쳐 세포 현 탁 액으로 처리 되어야 합니다. 와이어를 연결할 셀 수 있도록 30 분 동안 5 rpm에서 기울이면된 롤러 믹서에 튜브를 회전 합니다. 5 mL 1 x PBS와 와이어를 헹 구 고 시각적인 검사까지 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 2-6 ° C에서 어둠 속에서 그것을 저장.참고: 와이어의 기능 부분 PBS 셀을 해치지 않으려면 항상 침수 해야 합니다. 말 초 혈액과 인공 혼합물에서 대상 셀을 분리 (대체 메서드를 충전: 2.1. 세포 현 탁 액의 큰 볼륨을 사용 하 여 와이어를 충전) 이라는 셀 (섹션 1.2.) 높은 세포 밀도와 세포 정지를 희석 (> 1000000 셀/mL), 그로 인하여 말 초 혈액에 추가 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 낮은 유지. 500 500 000 셀 주변 혈액 5 mL을 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 믹스. 저장 격실에서 철사를 제거, 와이어를 잡고 고무 캡을 제거 하 고 1 x PBS에 그것을 씻어. 새로운 튜브 캡 캡 튜브와 튜브에에 배치 되 기울이면된 롤러 믹서 기능 부분 아군된 피에 완전히 몰입 되도록 주사기 바늘 (20 G)를 사용 하 여 장치의 작동 하지 않는 부분으로 침투.참고: 와이어의 트리플 헬리컬 기능 부분 충전에 걸쳐 세포 현 탁 액으로 처리 되어야 합니다. 실시간에서 30 분 동안 5 rpm에서 기울이면된 롤러 믹서에 튜브를 품 어 1 x PBS에 와이어 3 번을 씻어 고 시각적인 검사까지 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 어둠 속에서 그것을 저장 합니다.참고: 와이어의 기능 부분 항상 셀을 해치지 않으려면 침수 해야 합니다. 낮은 볼륨 세포 현 탁 액에서 와이어를 충전 (충전 메서드를 대체: 2.1. 세포 현 탁 액의 큰 볼륨을 사용 하 여 와이어를 충전) 1 x PBS에 1000000 셀/mL에서 이라는 셀 resuspend 선반에 가로 150 m m 일회용 유리 파스퇴르 피 펫을 수정 합니다. 저장 격실에서 와이어를 제거 하지만 노란색 고무 모자는 와이어를 잡고 유지. 그런 기능성된 부분 유리 안 만질 파스퇴르 피 펫의 끝에 위치 하 고 피펫으로에 와이어를 놓습니다.참고: 와이어의 끝 파스퇴르 피 펫 팁에서 충실 하지 해야 합니다. 와이어를 잡고 고무 캡으로 파스퇴르 피 펫 팁의 끝부분을 연결 하지 마십시오. 꽉 연결 하는 경우 셀 정지 피 펫 팁으로 반대편에서 로드할 수 없습니다. 와이어의 기능성된 부분을 덮고 파스퇴르 피 펫의 끝에 세포 현 탁 액의 15 µ L를 로드 합니다. 품 어 10 분 수동으로 쿼터-턴에 대 한 와이어 조립된 와이어/파스퇴르 피 펫 팁 모든 분. 파스퇴르 피 펫 팁에서 와이어를 제거 하 고 린스 1 x PBS의 5 mL에 시각적인 검사까지 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 2-6 ° C에서 어둠 속에서 그것을 저장.참고: 기능 부분 1 x PBS 셀을 해치지 않으려면 항상 침수 해야 합니다. 3. 계산에 셀 참고: 항상 셀을 해치지 않으려면 1 x PBS에 빠져들 와이어의 기능적인 부분을 계속. 그리스 펜을 사용 하 여 유리 슬라이드에 사각형 영역을 그리기 및 1 x PBS의 500 µ L을 추가. 와이어의 작동 하지 않는 부분을 구 부를 기능적 부분 1 x PBS에 몰입 되도록 유리 슬라이드에 넣습니다.참고: 사각형의 영역에 맞는 완전히 커버 와이어의 기능적인 부분을 1 x PBS의 볼륨. 양면 접착 테이프를 사용 하 여 슬라이드에는 와이어의 작동 하지 않는 부분을 탑재. 시각적으로 캡처된 셀 (그림 2B 2 층)을 열거 하는 와이어의 양쪽 모두를 검사 합니다.참고: 셀의 존재 DAPI와 FITC 필터 장착 형광 현미경을 사용 하 여 결정 됩니다. 와이어의 양쪽 모두를 검사할 수 있습니다 그리고 셀 수 또는 (높은 셀 번호)에 대 한 평가 (셀의 낮은 수는 와이어에 연결 된 경우에 가능) 계산. 셀의 열거형 필요 하지 않은 경우이 단계를 생략 수 있습니다. 스캔 후, 다시 1 x PBS를 포함 하는 15 mL 튜브에 와이어를 배치 (2.3.6 참고. 및 3.), 어둠에 와이어를 저장.참고: 와이어의 작동 하지 않는 일부의 대부분 (를 포함 하 여 벤드) 잘라 수 있으며 감속/가속 저장소 제거. 4. 분리 및 대상 셀의 복구 참고: 셀의 분리 한다 할 수 4 h 이내 격리 후. 1 x PBS의 mL 당 4 mg의 릴리스 버퍼 구성 요소 (테이블의 재료 및 시 약)을 녹이 고 솔루션 준비-사용 버퍼를 0.2 µ m 살 균 필터를 통해 필터링.참고: 와이어의 폴리머는 EpCAM 제시 대상 셀에 대 한 바인딩을 허용 하는 안티-EpCAM 항 체와 공업화는 히드로의 구성 됩니다. 릴리스 버퍼 탄소-산소 분해 효소는 히드로 고착의 수를 포함 합니다. 위하여 분열 결과 폴리머 저하, 따라서, 캡처된 셀의 분리. 전 5 분 동안 37 ° C에서 릴리스 버퍼 따뜻한. 1.5 mL 반응 관을 채우기 위해 릴리스 버퍼의 1.6 mL를 추가 합니다.참고: 튜브 1.5 mL 반응 볼륨에 대 한 설계는 와이어의 기능적인 부분을 물속에 필요한 1.6 mL의 응용 프로그램 수 있습니다. 오염 물 욕조에 부 화 하는 동안을 피하기 위해 1.5 mL 튜브에는 와이어를 해결 하기 위해 튜브 캡 대신 와이어와 함께 제공 된 고무 캡을 사용 하는 20 분 37 ° C (물 탕)에 릴리스 버퍼에 와이어의 기능 일부를 품 어. 15 분에 대 한 RT와 500 rpm에서 통 하 와이어/튜브 어셈블리를 전송 합니다.참고: 뿌리는 1.5 m m의 궤도. 원심 분리기에 와이어/튜브 어셈블리를 놓고 10 분에 대 한 300 x g 에서 회전 합니다. 튜브에서 와이어를 제거 하 고 뚜껑을 닫고 10 분에 대 한 300 x g 에서 다시 튜브 원심.참고: 와이어 저장할 수 있습니다 2-6 ° C에서 1 x PBS에 셀 계산 분리 효율/확인에 남아 있는 셀에 대 한 평가를 위해 어둠 속에서. 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 줄이기 위해, 100 µ L (micromanipulation)를 제외한 모든 나는 상쾌한 또는 300 µ L (cytocentrifugation 및 후속 레이저 기정)를 제거 하 고 즉시 단일 셀 샘플링을 진행 합니다. 5. 단일 셀 샘플링 Micromanipulation참고: 단일 세포 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 WGA 허용의 2 µ L에 추가 됩니다. 처리, pipetting 및 장소 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 얼음으로 인 한 손실에 대 한 추가 볼륨을 계산 하는 셀의 수에 따라 마스터 믹스를 준비 합니다. 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 (WGA 키트, 테이블의 재료 및 시 약의구성 요소) Czyż 외18에 의해 제시 된 프로토콜에 따라 준비 합니다. 간단히, 혼합 반응 버퍼, octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 용액)의 1.3 µ L, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)의 1.3 µ L의 2.0 µ L 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜 (10% 용액), 가수분해 K 솔루션의 2.6 µ L 및 12.8 µ L를 물 RNase/DNase 무료 한 10 샘플 (총 볼륨 20 µ L)에 대 한 마스터 믹스.참고: 더 많은 샘플에 대 한 증가 볼륨 따라. 세포 세포의 용 해 마스터 믹스의 구성 레이저 서 샘플 (5.2 참조)를 활용 하 여 대체 절차에서 사용 되는 것에서 차이가 있다. 그리스 펜을 사용 하 여 장소에 세포 현 탁 액을 들고 영역을 그립니다. 셀 밀도 너무 높은 경우 지역 및 볼륨 조정 (즉. 유리 슬라이드에 더 큰 영역을 표시, PBS와 세포 현 탁 액의 약 수 x 1을 로드). 전체 스테인드 세포 현 탁 액 (단계 4.8에서에서 얻은) 유리 슬라이드에 플라스틱 유리 슬라이드는 micromanipulator 갖춘 현미경에 전송. 5 분 (그림 2D 와 2 H)에 정착 하는 셀을 하자. 준비 0.2 mL PCR 튜브 셀 세포 마스터의 2.0 µ L 로드 (단계 5.1.1 참조.)을 혼합 하 고 얼음에 저장 합니다. 1 x PBS는 micromanipulator를 사용 하 여의 1 µ L에 단일 셀을 수집 하 고 세포 세포 세포의 용 해 마스터 믹스를 포함 하는 관으로 전송.참고: micromanipulated 세포 세포 세포의 용 해 버퍼에 전송 하기 위한 모 세관 세포 솔루션의 2 µ L에 직접 놓고 꺼낼 때까지 거품을 볼 수 있다. 짧게 스핀 2000 x g 3에서 샘플 다운 튜브의 하단에 모든 액체를 수집 하는 데스크톱 microfuge를 사용 하 여 s. 얼음에 샘플을 놓습니다. 단일 셀 WGA에 직접 진행 (참조 6. 및 Czyż 외. 19)입니다. 서 레이저 (대체 단일 셀 샘플링 방법: 5.1. Micromanipulation)참고:이 섹션에서 사용 되는 마스터 믹스의 구성 섹션 5.1에서에서 micromanipulation에 사용에서 다릅니다. 단일 세포 세포 세포의 용 해 마스터 믹스 (WGA 키트, 테이블의 재료 및 시 약의구성 요소)의 4.5 µ L에 WGA에 대 한 추가 됩니다. Czyż 그 외 여러분 에 따르면 셀 세포 마스터 믹스를 준비 19 반응 버퍼, octylphenoxypolyethoxyethanol (10% 용액)의 1.3 µ L, 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)의 1.3 µ L의 5.0 µ L를 혼합 하 여 페 닐 폴 리 에틸렌 글리콜 (10% 용액), 거동, 가수분해 K 솔루션의 2.6 µ L, RNase의 34.8 µ L / 10 샘플 (총 볼륨 45 µ L)에 대 한 마스터 믹스를 DNase 무료 물. 얼음에 마스터 믹스를 놓습니다.참고: 더 많은 샘플에 대 한 증가 볼륨 따라. UV 치료 막 코팅 슬라이드 레이저 기정에 적합합니다. 따라서 슬라이드 교차 하는 링커 장치 DNA에 놓고 약 10 분에 대 한 높은 UV에 노출 합니다. Cytocentrifuge와 cytospin 300 x g 5 분에 전체 세포 현 탁 액 막 코팅 슬라이드 조립.참고: 셀 cytocentrifuged 솔루션에서 슬라이드에 있는 액체에 시스템을 사용 하 여 때 cytocentrifugation 후는 상쾌한을 제거 하 고 1 분 동안 1140 x g 에서 드라이 스핀을 적용. 서 레이저 또는 cytospins 하룻밤 건조 및 장기 저장을 위한-20 ° C에서 샘플을 동결 하자 직접 진행 합니다. 4.5 µ L 0.2 mL PCR 튜브의 캡에 세포 세포의 용 해 마스터 믹스의 플라스틱 그리고 레이저 기정에 의해 단일 세포를 수확. 레이저 서 현미경에서 PCR 튜브를 검색 하 고 튜브를 닫습니다. 짧은 회전 하 여 튜브의 하단에 모든 액체를 수집 하 고 얼음에 샘플을 놓습니다. 단일 셀 WGA 진행 하십시오 또는 추가 처리 전에 최대 1 개월-80 ° C에 격리 샘플을 저장. 6. 어댑터-링커 기반 전체 게놈 증폭 18,19 참고: 모든 필요한 마스터 믹스 (WGA 키트, 테이블의 재료 및 시 약의구성 요소)는 준비 하 고 사용할 준비 얼음에 저장 된 다는 것을 확인 하십시오. 마스터 믹스 포함 micromanipulated에 대 한 DNA 소화 믹스 1 (5.1 참조.) 샘플 (반응 버퍼의 2.0 µ L, Mse의 2.0 µ L을 포함 나 제한 효소, RNase/DNase 무료 물 16.0 µ L) 또는 2 레이저 서 혼합 DNA 소화 (5.2 참조). 샘플 ( Mse의 2.5 µ L을 포함 나 제한 효소, RNase/DNase 무료 물 2.5 µ L), 미리 어 닐 링 마스터 믹스 (반응 버퍼의 5.0 µ L, preannealing PCR 어댑터의 각 5.0 µ L 및 15.0 µ L RNase/DNase 무료 물 포함), 결 찰 마스터 믹스 (미리 단련된 PCR 어댑터, 10.0 µ L 아데노신 3 인산 염 해결책, 및 10.0 µ L T4 리가 솔루션의 30.0 µ L 포함) 및 기본 PCR 주인 혼합 (포함 30.0 µ L PCR 버퍼, 10 m m deoxynucleotide 믹스 솔루션의 20.0 µ L, 한 중 합 효소의 10.0 µ L의 혼합 고 RNase/DNase 무료 물 340.0 µ L). 모든 볼륨 10 샘플을 준비 하기 위한 제공 됩니다. 그에 따라 조정 샘플의 수를. 세포 세포의 용 해에 대 한 열 cycler에 micromanipulated/레이저 서 샘플을 놓고 45 분, 30 분 및 10 분 동안 80 ° C 65 ° C 42 ° C에서 세포를 배양 하 여 단일 세포 세포의 용 해를 실행 합니다.참고: 온수 뚜껑 열 cycler를 사용 합니다. 세포 세포의 용 해는 10 ~ 15 h O/N 할 수 있습니다. 이 경우, 65 ° c.에 인큐베이션 단계를 생략 미리 어 닐 링 PCR 어댑터의 실행 합니다. 따라서, 1 분 뒤에 추가 49 주기, 1 분 각, 65 ° C에서 열 cycler에서 미리 어 닐 링 마스터 믹스를 품 어 점점 감소 하는 온도 1 ° c와 함께/사이클. (15 ° C)에서 50 사이클 후 추가 사용까지 15 ° C에서 마스터 믹스를 품 어.참고:이 단계는 결 찰에 대 한 적합 한 비대칭 어댑터를 생성 하는 데 필요한 (단계 6.6 참조). 단일 세포 dna를 받게 Mse나 제한 다이제스트. 세포 세포의 용 해, 후 스핀 2000 x g 3에서 lysed 샘플 다운 하단에 모든 액체를 수집 하 고 얼음에 배치 하는 s. DNA 조각, 각 lysed micromanipulated 샘플을 DNA 소화 믹스 1의 2 µ L를 추가 하거나 DNA 소화의 0.5 µ L 2 레이저 서 샘플에 혼합 하 고 제한 다이제스트를 실행 합니다. 5 분 동안 65 ° C에서 제한 효소 비활성화 단계 뒤 5 분 동안 37 ° C에 온수 뚜껑 열 cycler를 사용 합니다.참고: 소화 37 ° C에서 3 h 연장 될 수 있습니다. 이것은 micromanipulation에서 가져온 샘플 및 레이저 기정에서 얻은 샘플 사이의 서로 다른 유일한 프로토콜 단계 이다. 하단에 모든 액체를 수집 하 여 얼음에 샘플 아래로 회전 합니다. Ligating 소화 제한 DNA와 미리 단련된 어댑터, 결 찰 마스터의 5.0 µ L을 추가 대 한 각 소화 DNA 샘플을 혼합 하 고 1 시간에 15 ° C에서 열 cycler에 선.참고:이 단계 12 h에 확장 될 수 있습니다 또는 O/n. 실행 하단에 모든 액체를 수집 하 여 얼음에 샘플 아래로 회전 합니다. 결 찰 제품의 각 기본 PCR 마스터 믹스의 40.0 µ L WGA에 대 한 추가 다음과: 처음으로 온수 뚜껑 열 cycler에 WGA를 실행, 3 분 동안 68 ° C에서 샘플을 품 어. 둘째, 40에 대 한 94 ° C에서 15 번에 대 한 주기 s, 57 ° C 30에 대 한 s와 1 분 30 s + 1 s/사이클에 대 한 68 ° C. 다음 40 94 ° C에서 9 주기를 추가 s, 57 ° C + 1 ° C/사이클 30 s, 1 분 45 s + 1 s/사이클에 대 한 68 ° C. 그 후, 23 번 40 94 ° C에 대 한 주기 s, 65 ° C 30 s, 1 분 53 s + 1 s/사이클에 대 한 68 ° C. 마지막으로, 3 분 40 s 68 ° C에서 최종 확장을 수행 하 고 진정 4 ° c 샘플 샘플 하단에 모든 액체를 수집 하 고 DNA 품질 확인 또는-20 ° C 또는 장기 저장을 위한-80 ° C에서 샘플 저장을 아래로 회전 합니다. 7입니다. WGA 제품의 품질 관리 참고: 4plex QC PCR 5를 실행 한 후 DNA 검사 및 증폭 제품의 수의 범위에 따라 WGA 제품의 품질을 확인 하십시오. 평가 대 한 1.0 %agarose 젤에 WGA aliquots 및 각 QC PCR 샘플을 실행 합니다. 모든 뇌관 4plex 품질 관리 PCR (표 1)에 대 한 사용의 100 µ M 재고 솔루션을 준비 합니다. 뇌관 풀의 200 µ L를 생성 하기 위해 PCR 급 물 136.0 µ L를 모든 뇌관의 8 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 3에 대 한 솔루션 s 2000 x g 3 s와 약 수 20 µ L-20 ° c.에 저장에서 스핀 다운 멀티플렉스 PCR 마스터를 준비 하려면 사용 표준 PCR 키트 포함 6.0 µ L 2 x PCR (프라이 머)를 제외 하 고, 물이 PCR 급의 4.5 µ L 컴포넌트와 뇌관 풀의 0.5 µ L의 혼합. WGA 제품의 1.0 µ L을 추가, 스핀 다운 및 실행된 PCR 2 분 동안 94 ° C에서 1 분, 1 분, 1 분 30 s 72 ° C에 뇌관 연장 위한 56 ° C와 최종 확장 단계에 단련 하는 뇌관 94 ° C에서 변성의 35 주기 뒤 7 분을 위한 72 ° C에서 4 ° C에 진정, 스핀 다운 고 젤 분석 같은 날 또는 나중에 분석-20 ° C에서 얼음에 샘플을 놓습니다.참고: Peltier 요소의 장 수를 증가에 12 ° C에서 수행할 수 있습니다 열 cycler에서 놀 아 요. WGA (6.8에서 획득) 및 각각 4plex QC PCR 제품 agarose 젤5에 분석.