Cellule intere correnti indotte dall'applicazione di Puff di GABA nelle fette del cervello
Summary
Descriviamo la tecnica di soffio, da cui reagenti farmacologici possono essere somministrati durante la registrazione di cellule intere patch-clamp ed evidenziano vari aspetti delle caratteristiche che sono cruciali per il suo successo.
Abstract
Amministrazione farmacologica è comunemente usato quando lo svolgimento di cellule intere patch-clamp registrazione nelle fette del cervello. Uno dei migliori metodi di applicazione della droga durante la registrazione elettrofisiologica è la tecnica di soffio, che può essere utilizzata per studiare l’effetto dei reagenti farmacologici sulle attività neuronale nelle fette del cervello. Il grande vantaggio di applicazione puff è che la concentrazione di droga intorno al sito di registrazione aumenta rapidamente, impedendo così la desensibilizzazione dei recettori di membrana. Riuscito uso di applicazione di soffio comporta particolare attenzione ai seguenti elementi: la concentrazione del farmaco, i parametri della micropipetta soffio, la distanza tra la punta di una micropipetta di soffio e il neurone registrati e la durata e pressione guidando il puff (libbre per pollice quadrato, psi). Questo articolo descrive una procedura dettagliata per la registrazione di cellule intere correnti indotte da sbuffando acido gamma – aminobutirrico (GABA) su un neurone di una fetta di corticale prefrontale. In particolare, la stessa procedura può essere applicata con lievi modifiche per altre zone del cervello come l’ippocampo e lo striato e per diverse preparazioni, quali colture cellulari.
Introduction
La tecnica del patch-clamp, uno strumento primario per lo studio di segnali elettrici nei neuroni, è stata sviluppata in anni 19701,2. Dei principali vantaggi di questa tecnica è che esso fornisce conoscenza su come specifici trattamenti (ad es., farmacologico) può alterare funzioni neuronali o canali in tempo reale3. Valutazione farmacologica di funzione di un neurone durante la registrazione in una fetta di cervello cellule intere richiede l’applicazione di farmaci, come gli agonisti o antagonisti dei recettori specifici, i neuroni in fase di registrazione. Questo metodo permette l’identificazione di alterazioni neuronali che si verificano dopo l’applicazione di un farmaco specifico, portando così a una migliore comprensione delle proprietà fisiologiche e patologiche dei neuroni4. Sebbene amministrazione farmacologica possa essere condotte via sia5 o soffio di aspersione6, quest’ultima è la tecnica superiore. In particolare: (i) puff applicazione rapidamente aumenta farmaco concentrazione intorno il neurone registrato ad un livello tale che è impedita la desensibilizzazione dei recettori di membrana; (ii) il volume di droga soffiato è estremamente basso, affinché ci sia scarso effetto sulla soluzione del bagno, che pertanto riduce eventuali effetti indesiderati dei prodotti chimici amministrati su fettine di cervello; (iii) il protocollo di soffio può essere impostato e salvato, rendendo l’esperimento molto precisamente riproducibile; (iv) soffio applicazione rappresenta l’uso economico di agonisti/antagonisti, in particolare qualora tali reagenti siano costose o difficili da ottenere.
Qui, ci concentreremo sulla registrazione cellule intere correnti indotte da sbuffando GABA nelle fette del cervello acutamente preparato, una preparazione che ha il vantaggio di circuiti cerebrali relativamente ben conservato. Come conduciamo correnti inibitorie indotta da soffio7 sarà descritti in questo articolo. Utilizzando cesio (Cs+)-base di soluzioni interne e che tiene i neuroni a 0 mV, introdurremo GABA-puff evocato correnti postsinaptiche inibitorie (ampiezza) con dettagli tecnici appropriati. Utilizzando un modello murino di depressione indotta dal lipopolysaccharide (LPS) iniezione8, indichiamo che il eIPSC ampiezza evocata da un soffio di GABA è ridotta significativamente in fette di topi iniettati LPS rispetto ai comandi del veicolo. La nostra intenzione è che questo articolo dovrebbe mostrare come la tecnica di soffio è ampiamente applicabile a studi mirati a valutare l’effetto di sostanze chimiche, farmaci o composti sulle attività neuronale nelle fette del cervello.
Protocol
Representative Results
Discussion
Applicazione di soffio viene ampiamente utilizzata per valutare il recettore postsinaptico funzione3,4,7, ma richiede un controllo preciso in ogni esperimento. Descriviamo qui una procedura che coinvolge cellule intere patch di bloccaggio, che dimostra che GABA-puff indotto IPSCs (cioè, ampiezza) nelle fette del cervello corticale prefrontale. La resistenza dell’elettrodo di registrazione è MΩ circa 5, mentre il diametro dell…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare le seguenti organizzazioni: National Natural Science Foundation of China (31171018, 31171355), scienza e tecnologia divisione di Guangdong (2013KJCX0054), la Fondazione di scienze naturali della provincia di Guangdong ( 2014A030313418, 2014A030313440), Guangzhou scienza e tecnologia Bureau (201607010320).
Materials
| Glass Borosilicate micropipettes | Shutter Instruments | BF150-86-10 | 1.50 mm outer diameter; 0.86 mm inner diameter |
| Micropipette Puller | Shutter Instruments | MODEL P-97 | Flaming/Brow Micropipette Puller |
| Micromanipulators | Shutter Instruments | MP-285 | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Imaging Camera | Nikon | 2115001 | Inspection equipment |
| Microscopy | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Master 8 | A.M.P.I. | Master-8 Pulse stimulator | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT 1000S | |
| Picospritzer Ⅲ | Parker Hannifin | Pressure Systems for Ejection of Picoliter Volumes in Cell Research |
|
| Razor blade | Gillette | 74-S | FLYING EAGLE |
| Video monitor | Panasonic | WV-BM 1410 | |
| 502 Glue | Deli | 7146 | Cyanoacrylate Glue |
| Peristaltic pump | Shanghai JIA PENG Corporation | BT100-1F | |
| Video Camera | Olympus America Medical | OLY-150 | |
| Transfer Pipets | Biologix | 30-0138A1 |
Referenzen
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