Purificazione di DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate
Summary
L’obiettivo del presente protocollo è specificamente tag e isolare selettivamente il DNA virale da cellule infettate per la caratterizzazione delle proteine del genoma virale associato.
Abstract
L’obiettivo del presente protocollo è per isolare il virus herpes simplex tipo 1 (HSV-1) DNA da cellule infettate per l’identificazione di associato virale e proteine cellulari di spettrometria di massa. Anche se le proteine che interagiscono con genomi virali svolgono un ruolo importante nel determinare l’esito dell’infezione, un’analisi completa delle proteine del genoma virale associato non era in precedenza fattibile. Qui dimostriamo un metodo che consente la purificazione diretta del genoma di HSV-1 da cellule infette. Replica del DNA virale in modo selettivo è etichettata con nucleotidi modificati che contengono un gruppo funzionale di alchini. Con etichetta DNA quindi è specificamente e irreversibilmente contrassegnato tramite il legame covalente di azide biotina tramite un rame (I)-catalizzato reazione di cicloaddizione o clic di azide-alchino. Biotina-etichetta DNA viene purificata su rivestite di streptavidina e proteine associate sono eluite e identificate mediante spettrometria di massa. Questo metodo consente il targeting selettivo e l’isolamento di HSV-1 replica forchette o interi genomi da ambienti biologici complessi. Inoltre, l’adattamento di questo approccio vi permetterà per l’indagine sui diversi aspetti della infezione herpesviral, nonché l’esame dei genomi di altri virus a DNA.
Introduction
I virus hanno una limitata capacità di svolgere le funzioni essenziali e pertanto dipendono da fattori dell’ospite per facilitare gli aspetti critici dell’infezione compreso trasporto, replica, riparazione, ricombinazione ed espressione genica virale. Le attività di questi fattori dell’ospite sono spesso aumentate di proteine codificate virally. Inoltre, virus deve evitare il rilevamento e interferenze di risposte cellulari all’infezione virale. Di conseguenza, interazioni ospite virus dettano l’esito dell’infezione. Di fondamentale importanza è capire come virus alterano l’ambiente cellulare per adattare il macchinario cellulare per facilitare processi virali. Di particolare interesse è identificare i fattori e i processi agiscono sui genomi virali durante tutto il ciclo infettivo.
Herpes simplex virus tipo 1 (HSV-1) è che una doppia elica del DNA virus che infetta una parte sostanziale della popolazione umana. Entro la prima ora di infezione, il genoma virale entra nel nucleo, dove una cascata ordinata dell’espressione genica virale ensues in coordinamento con virale del DNA (vDNA) replica1. Nel nucleo, genomi sono soggetti a regolazione epigenetica, sottoposti a riparazione e ricombinazione e sono confezionati in capsidi, tale che i primi virioni di progenie sono prodotte in meno di sei ore. La valutazione completa delle proteine del genoma virale associato durante tutto il corso dell’infezione getterà le basi per indagare i dettagli molecolari dei processi che agiscono sui genomi virali e forniranno la comprensione di quali fattori virali e cellulari sono coinvolti nelle varie fasi dell’infezione.
Metodi precedenti per l’indagine sui fattori dell’ospite coinvolti nell’infezione virale includono purificazione di affinità delle proteine virali per l’analisi di proteine cellulari associati2,3,4,5 , 6 , 7 , 8 , 9. questi saggi sono stati strumentali per l’identificazione di fattori cellulari coinvolti nella risposta antivirale ospite, così come modifica virale della cromatina, espressione genica, e riparazione del DNA. Tuttavia, è difficile da accertare se interazioni dipendono l’associazione con vDNA e proteomica solo consentono di comprendere le interazioni che si verificano in funzione di uno specifico fattore virale. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è stato utilizzato per identificare dove specifiche proteine virali e cellulari legano al genoma virali10,11,12,13,14 , 15 e ibridazione in situ fluorescente (FISH) combinato con immunocitochimica ha permesso la visualizzazione dei fattori cellulari che colocalize con vDNA16,17,18, 19 , 20. queste analisi consentono analisi spazio e temporale. Tuttavia, le limitazioni comprendono la necessità per gli anticorpi altamente specifici, sensibilità limitata e la necessità di approfondimenti precedenti interazioni ospite di virus. Abbiamo pertanto sviluppato un metodo basato su iPOND (isolamento delle proteine sul DNA nascente)21 e aniPOND (accelerata nativo iPOND)22 per selettivamente etichettare e purificare vDNA da infettato le cellule per l’imparziale identificazione del genoma virale proteine associate mediante spettrometria di massa. iPOND è stato determinante per l’indagine delle dinamiche di forcella di replicazione cellulare.
Per la purificazione selettiva di genomi virali da cellule infette, la replica di vDNA è etichettata con nucleosidi Etinil per volta, 5-Etinil-2-deoxyuridine (EdU) o 5-Etinil-2-deoxycytidine (EdC) (Figura 1), seguita da covalente Coniugazione di azoturo di biotina tramite clic su chimica per facilitare purificazione singolo passo del genoma virale e proteine associate su perline rivestite con streptavidina (Figura 2B). D’importanza, le infezioni avvengono nelle cellule fisse, che non sono impegnate nella replicazione del DNA cellulare per attivare specifici di etichettatura di vDNA. Inoltre, l’infezione HSV-1 provoca l’arresto del ciclo cellulare ed inibisce cellular DNA replica23,24. Virus può essere prelabeled prima dell’infezione per l’analisi di proteine associate con genomi virali in ingresso (Figura 1A) o con l’etichetta durante la replicazione del DNA per l’analisi di proteine associate con vDNA recentemente sintetizzato (Figura 1B) 25. Inoltre, analisi di inseguimento di impulso possono essere utilizzato per indagare la natura di proteine associate con replicazione virale forcelle (Figura 1)26. Inoltre, vDNA Etinil-modificato può essere coniugato covalentemente a un fluoroforo per indagine spaziale della dinamica della proteina (Figura 2A e Figura 3). Formazione immagine permette la visualizzazione diretta del vDNA è un approccio gratuito per la validazione delle interazioni della proteina-vDNA e può essere adattata per tenere traccia di genomi virali durante l’infezione. Ci aspettiamo che questi approcci potrebbero essere ulteriormente modificati per studiare qualsiasi aspetto dell’infezione herpesviral, compresa la latenza e riattivazione e di studiare altri virus a DNA. Inoltre, etichettatura con uridina 5-Etinil potrebbe consentire l’analisi di genomi virali RNA (UE).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo include più passaggi che, se non seguite con attenzione, possono provocare rese significativamente riduttrice della proteina o contaminazione con DNA cellulare. È fondamentale che cellule stazionarie sono utilizzate per tutti gli esperimenti per garantire che DNA cellulare non è etichettato e purificato. Questo può essere confermato dall’assenza di polimerasi del DNA cellulare del campione di proteine perché HSV-1 non utilizzare il cellulare DNA polimerasi per la sintesi di genoma. Durante EdC etic…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo Hannah Fox per aiuto nella preparazione di questo manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01AI030612.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
Referenzen
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