تنقية الحمض النووي الفيروسي للتعرف على البروتينات الفيروسية والخلوية المرتبطة بها
Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو علامة على وجه التحديد وعزل الحمض النووي الفيروسي من الخلايا المصابة لتحديد خصائص البروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة بشكل انتقائي.
Abstract
والهدف من هذا البروتوكول هو عزل فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) الحمض النووي من الخلايا المصابة لتحديد المرتبطة الفيروسية والبروتينات الخلوية بالكتلة قياس الطيف الكتلي. على الرغم من أن البروتينات التي تتفاعل مع الجينوم الفيروسي تضطلع بأدوار رئيسية في تحديد نتيجة العدوى، تحليلاً شاملا للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة لم يكن ممكناً سابقا. هنا نظهر أسلوب يتيح لتنقية مباشرة من هامبورغ-1 مورثات من الخلايا المصابة. تكرار الحمض النووي الفيروسي هو المسمى بشكل انتقائي مع تعديل النيوكليوتيدات التي تحتوي على مجموعة وظيفية ألكاين. الحمض النووي المسمى هو ثم على وجه التحديد ولا رجعة فيه معلم عن طريق إلحاق التساهمية أزيد البيوتين عن طريق لنحاس (I)-حفز أزيد-ألكاين سيكلواديتيون أو انقر فوق رد. هو تنقية الحمض النووي معلم البيوتين في الخرز المغلفة ستريبتافيدين والبروتينات المرتبطة التيد وحددها الكتلي. يتيح هذا الأسلوب بالاستهداف الانتقائي والعزلة من هامبورغ-1 النسخ المتماثل شوك أو الجينوم كله من البيئات البيولوجية المعقدة. وعلاوة على ذلك، سوف تسمح التكيف مع هذا النهج للتحقيق في الجوانب المختلفة للإصابة هيربيسفيرال، فضلا عن فحص مورثات فيروسات الحمض النووي الأخرى.
Introduction
فيروسات لديها قدرة محدودة على الاضطلاع بالمهام الأساسية، وذلك يعتمد على عوامل المضيف لتسهيل الجوانب الحرجة للإصابة بما في ذلك التعبير المورثات الفيروسية والنسخ المتماثل، إصلاح، وممارسو والنقل. وكثيراً ما تزاد أنشطة هذه العوامل المضيفة بالبروتينات المرمزة فيروسي. وبالإضافة إلى ذلك، يجب تجنب الفيروسات الكشف والتدخل بالاستجابات الخلوية للعدوى الفيروسية. ولذلك، تملي التفاعلات المضيف الفيروس نتيجة الإصابة. من الأهمية بمكان هو فهم كيفية تغير فيروسات البيئة الخلوية تكييف الآلية الخلوية لتسهيل عمليات الفيروسية. أهمية خاصة هو تحديد العوامل والعمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي طوال دورة المعدية.
فيروس الحلأ البسيط من النوع 1 (هامبورغ-1) هو مزدوج تقطعت الحمض النووي الفيروس الذي يصيب نسبة كبيرة من السكان. خلال الساعة الأولى من الإصابة، يدخل الجينوم الفيروسي النواة، حيث تستتبعه تتالي أمر التعبير المورثات الفيروسية في التنسيق مع النسخ المتماثل (فدنا) من الحمض النووي الفيروسي1. في النواة، جينومات تخضع لضوابط تنظيمية جينية والخضوع لإصلاح واقترانها، ويتم تعبئتها في كابسيدس، حيث يتم إنتاج فيريونس ذرية الأولى خلال أقل من ست ساعات. التقييم الشامل للبروتينات الفيروسية الجينوم المرتبطة طوال فترة الإصابة سترسي الأساس للتحقيق في تفاصيل العمليات التي تعمل على الجينوم الفيروسي، وسوف توفر نظرة ثاقبة العوامل الفيروسية والخلوية التي الجزيئية يشاركون في مراحل مختلفة من العدوى.
وتشمل الأساليب السابقة لتحقيق العوامل المضيفة المعنية في العدوى الفيروسية تقارب تنقية البروتينات الفيروسية لتحليل البروتينات الخلوية المرتبطة بها2،3،،من45 , 6 , 7 , 8 , 9-هذه الاختبارات كانت مفيدة للتعرف على العوامل الخلوية التي ينطوي عليها في الردود المضادة للفيروسات المضيفة، فضلا عن تعديل الكروماتين الفيروسية، والتعبير الجيني، وإصلاح الحمض النووي. ومع ذلك، من الصعب التأكد من ما إذا كانت التفاعلات تعتمد على الرابطة مع فدنا، والبروتيوميات فقط توفير نظرة ثاقبة التفاعلات التي تحدث كدالة لعامل فيروسية معينة. وقد استخدمت إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) لتحديد حيث ربط محددة من البروتينات الفيروسية والخلوية للجينوم الفيروسي10،،من1112،،من1314 , 15 والتهجين في الموقع نيون (الأسماك) جنبا إلى جنب مع إيمونوسيتوتشيميستري وقد مكن تصور العوامل الخلوية التي كولوكاليزي مع، فدنا16،،من1718 19 , 20-تتيح هذه الاختبارات للتحليل المكاني والزماني. ومع ذلك، تشمل القيود الحاجة إلى أجسام مضادة محددة للغاية، وحساسية محدودة، والحاجة إلى ثاقبة الفيروس المضيف التفاعلات السابقة. ولذلك قمنا بتطوير أسلوب يقوم على إيبوند (عزل البروتينات على الحمض النووي الوليدة)21 والمصابين أنيبوند (إيبوند الأصلية المعجل)22 للتسمية بشكل انتقائي وتنقية فدنا من الخلايا لتحديد غير منحازة للجينوم الفيروسي البروتينات المرتبطة بالطيف الكتلي. إيبوند كان مفيداً لتحقيق ديناميات شوكة الخلوية النسخ المتماثل.
لتنقية الانتقائي للجينوم الفيروسي من الخلايا المصابة، تكرار فدنا هو المسمى مع اثينيل تعديل نوكليوسدس، 5-اثينيل-2´-ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-اثينيل-2´-ديوكسيسيتيديني (EdC) (الشكل 1)، تليها التساهمية انقر اقتران لأزيد البيوتين عن طريق الكيمياء تيسيرا لتنقية خطوة واحدة من الجينوم الفيروسي والبروتينات المرتبطة بها على الخرز streptavidin المغلفة (الشكل 2). الأهم من ذلك، تنفذ العدوى في الخلايا الثابتة، التي لم تشارك في تكرار الحمض النووي الخلوي لتمكين العلامات المحددة من فدنا. وعلاوة على ذلك، هامبورغ-1 العدوى يؤدي دورة الخلية اعتقال ويحول دون تكرار الحمض النووي الخلوي23،24. الفيروسات يمكن بريلابيليد قبل الإصابة للتحليل البروتينات المرتبطة بالجينوم الفيروسية الواردة (الشكل 1A) أو المسمى أثناء النسخ المتماثل للحمض النووي للتحليل البروتينات المرتبطة بالمركب حديثا فدنا (الشكل 1B) 25-وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام التحليل تشيس نبض التحقيق في طبيعة البروتينات المرتبطة بالنسخ المتماثل الفيروسية شوك (الشكل 1)26. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تساهمي مترافق تعديل اثينيل فدنا إلى فلوروفوري للتحقيق المكاني لديناميات البروتين (الشكل 2A و الشكل 3). تصوير يسمح للتصور مباشرة من فدنا وهو نهج مجانية للتحقق التفاعلات فدنا بالبروتين، ويمكن تكييفها لتعقب الجينوم الفيروسي في جميع أنحاء العدوى. ونحن نتوقع أن هذه النهج يمكن تعديله أيضا لدراسة أي جانب من الإصابة هيربيسفيرال، بما في ذلك الكمون وتنشيطها، ودراسة أخرى فيروسات الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، وضع العلامات مع أردين 5-اثينيل (الاتحاد الأوروبي) قد تسمح لتحليل الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويشمل هذا البروتوكول العديد من الخطوات التي، إذا لم تتبع بدقة، يمكن أن يؤدي إنتاج البروتين انخفاضا كبيرا أو تلوث بالحمض الخلوي. من الأهمية بمكان أن يتم استخدام الخلايا ثابتة لجميع التجارب لضمان أن الحمض الخلوي لا المسمى وتنقيته. هذا يمكن تأكيد عدم وجود بولمرس الحمض الخلوي في العينة البرو?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف هانا فوكس للحصول على مساعدة في إعداد هذه المخطوطة. أيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AI030612.
Materials
| MRC-5 cells | ATCC | CCL-171 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-082 | substituted with 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 12 mM (for growth in flasks) or 30 mM (for growth in dishes) sodium-bicarbinate |
| 600 cm2 tissue culture dish | Thermo Fisher Scientific | 166508 | |
| Tris Buffered Saline (TBS), pH 7.4 | 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM Tricine | ||
| HSV-1 stock | stocks with titers greater than 1×109 PFU/mL work best | ||
| Sephadex G-25 column (PD-10 Desalting Column) | GE Healthcare | 17085101 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-1 | |
| 5´-Ethynyl-2´-deoxycytidine (EdC) | Sigma-Aldrich | T511307 | Dissolve in DMSO to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| 2´-deoxycytidine (deoxyC) | Sigma-Aldrich | D3897 | Dissolve in water to prepare 40 mM stock, aliquot, and store at -20 °C |
| Nuclear Extraction Buffer (NEB) | prepare fresh (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sucrose, 0.5% Igepal) | ||
| Cell scraper | Bellco glass | 7731-22000 | Autoclave before use |
| Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| PBS, pH 7.2 (10x) | 1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (dilute to 1x in sterile water before use) | ||
| Copper (II) sulfate pentahydrate (CuSO4-5H2O) | Fisher Scientific | C489 | Prepare 100 mM stock and store at 4 °C for up to 1 month |
| (+) Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Freshly prepare 100 mM stock and store on ice until use |
| Biotin azide | Invitrogen | B10184 | Prepare 10 mM stock in DMSO, aliquot, and store at -20 °C for up to 1 year |
| Click Reaction Mix | prepare immediately before use by adding reagents in the indicated order (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotin Azide, 1 mL 100 mM sodium ascorbate) | ||
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | Dissolve in 1 mL water to prepare 50x stock, can store at 4 °C for up to 1 week, or directly add 1 pill to 50 mL buffer |
| freezing buffer | prepare fresh (7 mL 100% glycerol, 3 mL NEB, 200 μL 50x protease inhibitor) | ||
| Buffer B1 | prepare fresh (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B2 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x protease inhibitor) | ||
| Buffer B3 | prepare fresh (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x protease inhibitor) | ||
| Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipped with a 3 mm microtip probe | Sonics | VCX 130 | |
| Cell strainer | Falcon | 352360 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65601 | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 260750F | |
| 2X Laemmli sample buffer | Mix 400 mg of SDS, 2 mL 100% glycerol, 1.25 mL of 1 M Tris (pH 6.8), and 10 mg of bromophenol blue in 8 mL water. Store at 4 °C for up to 6 months. Before use add 1 M DTT to a final concentration of 200 mM. | ||
| cap locks for 1.5 mL tube | Fisher Scientific | NC9679153 | |
| Standard western blotting reagents | |||
| NOVEX Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 12-well tissue culture dish | Corning | 3513 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-545-100 | Autoclave before use |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-552-5 | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | dilute to 3.7% in 1x PBS before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 | prepare 3% in 1x PBS |
| Permeabilization buffer (0.5% Triton-X 100) | Sigma-Aldrich | T8787 | prepare 0.5% Triton-X 100 in 1x PBS |
| Click reaction cocktail – Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Molecular Probes | C10337 | prepare according to manufactorer's protocol |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H1399 | prepare 10 mg/mL in water, can store at 4 °C for up to 1 year |
| mouse anti-ICP8 primary antibody | Abcam | ab20194 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| mouse anti-UL42 primary antibody (2H4) | Abcam | ab19311 | Use a 1:200 dilution in 1x PBS |
| Goat anti-mouse 594-conjugated secondary antibody | Life Technologies | a11005 | Use a 1:500 dilution in 1x PBS |
| Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
| 2x SDS-bicarb solution | 2% SDS, 200 mM NaHCO3 | ||
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | mix 25:24:1 at least 1 day before use, store at 4 °C in the dark | ||
| chloroform:isoamyl alcohol | mix 24:1 at least 1 day before use, store at room temperature in the dark | ||
| 10x Tris EDTA (TE), pH 8.0 | 100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilute to 1x before use) | ||
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| 3 M sodium acetate pH 5.2 | |||
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen | Q32866 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Qubit assay tubes | Invitrogen | Q32856 | |
| Fluorescence microscope equipped with imaging software | |||
| Microcentrifuge for 1.5 mL tubes | |||
| Tabletop centrifuge for 15 and 50 mL tubes | |||
| Cell culture incubator | |||
| Biosafety cabinet | |||
| Heat blocks | 65 °C and 95 °C |
Referenzen
- Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields virology. , (2013).
- Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics. Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).
- Wagner, L. M., DeLuca, N. A. Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription. PloS One. 8, e78242 (2013).
- Taylor, T. J., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8. J Virol. 78, 5856-5866 (2004).
- Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors. Virology. 330, 487-492 (2004).
- Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology. Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).
- Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0. J Virol. 89, 220-229 (2015).
- Suk, H., Knipe, D. M. Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells. Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).
- Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex. J Virol. 84, 12504-12514 (2010).
- Sampath, P., Deluca, N. A. Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells. J Virol. 82, 2339-2349 (2008).
- Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities. J Virol. 80, 2358-2368 (2006).
- Cliffe, A. R., Knipe, D. M. Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection. J Virol. 82, 12030-12038 (2008).
- Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection. J Virol. 78, 9689-9696 (2004).
- Kent, J. R., et al. During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription. J Virol. 78, 10178-10186 (2004).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. J Virol. 82, 3530-3537 (2008).
- Catez, F., et al. HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons. PLoS Pathog. 8, e1002852 (2012).
- Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts. J Virol. 81, 10991-11004 (2007).
- Tang, Q., et al. Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10. J Virol. 77, 5821-5828 (2003).
- Ishov, A. M., Maul, G. G. The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition. J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).
- Maroui, M. A., et al. Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment. PLoS Pathog. 12, e1005834 (2016).
- Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA. Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).
- Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions. BioTechniques. 55, 204-206 (2013).
- Hobbs, W. E., DeLuca, N. A. Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0. J Virol. 73, 8245-8255 (1999).
- Lomonte, P., Everett, R. D. Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle. J Virol. 73, 9456-9467 (1999).
- Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes. PLoS Pathog. 11, e1004939 (2015).
- Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes. PLoS Pathog. 13, e1006166 (2017).
- Bjornberg, O., Nyman, P. O. The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme. J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).
- Chiou, S. H. DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex. J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).
- Kennedy, D. C., et al. Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions. J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).
- Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene. Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).
