JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemie

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

Abstract

חומצת גרעין Non-קנונית מבנה שניוני ש-g-quadruplexes (G4) מעורבים תהליכים תאיים מגוונים, כגון שכפול ה-DNA, שעתוק, עיבוד RNA טלומר התארכות. במהלך תהליכים אלה, חלבונים שונים לאגד ולפתור G4 מבנים לביצוע תפקידם. הפונקציה של G4 תלוי לעתים קרובות היציבות של מבנהו מקופל, חשוב לחקור כיצד G4 מחייב חלבונים להסדיר את היציבות G4. עבודה זו מציגה שיטה לטיפול יחיד מולקולות G4 באמצעות פינצטה מגנטי, אשר מאפשרת לימודים של ויסות G4 מחייב חלבונים על מולקולה בודדת G4 בזמן אמת. באופן כללי, שיטה זו מתאימה בהיקף רחב של יישומים מחקרים עבור אינטראקציות חלבונים/ליגנדים והתקנות על מבנים משניים שונים DNA או RNA.

Introduction

ארבע גדילי ה-DNA או RNA G4 מבנים לשחק תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים חשובים רבים1. חלבונים רבים מעורבים G4 איגוד ורגולציה, כולל טלומר מחייב חלבונים (טלומראז, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, גורמי שעתוק (nucleolin, PARP1)3, RNA עיבוד חלבונים (hnRNP A1, hnRNP A2)4helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5, שכפול ה-DNA קשורים חלבונים (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. חלבון מחייב ניתן לייצב או יציבות מבנים G4; במטרה לווסת את תפקודים ביולוגיים הבאים. היציבות G4 נמדדה על ידי תרמי התכה באמצעות אולטרה סגול (UV) או שיטות קיווטות (CD)7. עם זאת, בתנאים כאלה אינם פיזיולוגיים הרלוונטיים קשים להחיל על הלומדים את ההשפעות של איגוד חלבונים7.

ההתפתחות המהירה בטכנולוגיות מולקולה בודדת מניפולציה אפשרה מחקרים של קיפול, התגלגלות של biomolecule, כמו של ה-DNA או חלבון, ברמה מולקולה בודדת עם רזולוציה ננומטר בזמן אמת8. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), מלקחיים אופטיים, פינצטה מגנטי הם שיטות מניפולציה מולקולה אחת הנפוצות ביותר. לעומת AFM ומלקחיים אופטיים9, פינצטה מגנטי אפשר מדידות יציב של קיפול-התגלגלות הדינמיקה של מולקולה בודדת בימים באמצעות טכניקה הסחף נגד10,11.

כאן, פלטפורמה מניפולציה מולקולה בודדת באמצעות פינצטה מגנטי ללמוד ויסות G4 יציבות על ידי איגוד חלבונים הוא דיווח12,13. עבודה זו מתווה את הגישות הבסיסיות, כולל הכנה ערוץ מדגם וזרימה, ההגדרה של פינצטה מגנטי הכיול כוח. את הפקד כוח ואת הפרוטוקולים הסחף נגד כפי שמתואר בשלב 3 לאפשר זמן זמן מדידות תחת בקרת כוח שונים, כגון כוח קבוע (כוח קלאמפ) ואת קבוע טעינת לדרג (חיל-שיפוע) כוח-לקפוץ המדידה שלך. פרוטוקול כיול כוח המתוארים בשלב 4 מאפשרת כיול כוח של < 1 מיקרומטר היתדות קצר על כוח רחב טווח pN עד 100, עם השגיאה היחסית בתוך 10%. דוגמה של רגולציה היציבות של הליקאז RNA הקשורים AU-עשיר אלמנט (RHAU) הליקאז (כינוי DHX36, G4R1) משחק תפקידים חיוניים בפתרון ש-g4 RNA משמשת כדי להדגים את היישומים של זו פלטפורמה13.

Protocol

1. הכנה של G4 ה-DNA של מולקולה בודדת מתיחות הכן 5 '-תיול שכותרתו ו- 5 '-ביוטין תווית dsDNA מטפל באמצעות PCR באמצעות פולימראז DDNA על תבנית ה-DNA phage למבדא באמצעות 5 '-תיול ו- 5 '-ביוטין תחל 14 ( איור 1). שתי ידיות dsDNA יש תכולה גבוהה של GC (> 60%) כדי למנוע ה-DNA נמס כאשר DNA מת?…

Representative Results

הגדרת הניסוי למתיחת מולקולה בודדת G4 מוצג באיור4. חד-גדילי G4 ויוצרים רצף המורחב בין שתי ידיות dsDNA הייתה קשורה בין coverslip של חרוז פאראמגנטיים. כדי לחפש חרוז קשור dsDNA יחיד, overstretching assay בוצעה על ידי הגדלת הכוח במחירים טעינה קבועה. שלושה סוגי מדידות שימשו לעיתים קר…

Discussion

כמתואר לעיל, פלטפורמה עבור הלומדים את יציבות מכנית של ה-DNA G4 ו את האינטראקציות של חלבון ל G4 באמצעות פינצטה מגנטי מולקולה בודדת הוא דיווח. המלווה את הפלטפורמה, פרוטוקולים יעילים ביותר למציאת הקשר G4 DNA, מדידה של הדינמיקות קיפול-התגלגלות ויציבות המבנה G4 עם רזולוציה מיוחד ננומטר מפותחים. נעילת ?…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מודים מנג פאן על הגהה כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי סינגפור משרד של חינוך אקדמי מחקר קרן שורה 3 (MOE2012-T3-1-001) כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי דרך סינגפור Mechanobiology המכון כדי J.Y.; קרן המחקר הלאומי, משרד, סינגפור ראש הממשלה, תחת תכנית Investigatorship ה-NRF (ה-NRF Investigatorship פרס מס ‘ ה-NRF-NRFI2016-03 כדי J.Y.; קרן מחקר בסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזי (2017KFYXJJ153) לה Y.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Rhodes, D., Lipps, H. J. G-quadruplexes and their regulatory roles in biology. Nucleic Acids Res. 43 (18), 8627-8637 (2015).
  2. Brazda, V., Haronikova, L., Liao, J. C., Fojta, M. DNA and RNA quadruplex-binding proteins. Int J Mol Sci. 15 (10), 17493-17517 (2014).
  3. Gonzalez, V., Hurley, L. H. The C-terminus of nucleolin promotes the formation of the c-MYC G-quadruplex and inhibits c-MYC promoter activity. Biochemie. 49 (45), 9706-9714 (2010).
  4. Wang, F., et al. telomerase-interacting protein that unfolds telomere G-quadruplex and promotes telomere extension in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), 20413-20418 (2012).
  5. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  6. Schiavone, D., et al. PrimPol Is Required for Replicative Tolerance of G Quadruplexes in Vertebrate Cells. Mol Cell. 61 (1), 161-169 (2016).
  7. Lane, A. N., Chaires, J. B., Gray, R. D., Trent, J. O. Stability and kinetics of G-quadruplex structures. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5482-5515 (2008).
  8. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annu Rev Biophys. 43, 19-39 (2014).
  9. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  10. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophys J. 100 (2), 517-523 (2011).
  11. Chen, H., et al. Dynamics of equilibrium folding and unfolding transitions of titin immunoglobulin domain under constant forces. J Am Chem Soc. 137 (10), 3540-3546 (2015).
  12. You, H., Wu, J., Shao, F., Yan, J. Stability and kinetics of c-MYC promoter G-quadruplexes studied by single-molecule manipulation. J Am Chem Soc. 137 (7), 2424-2427 (2015).
  13. You, H., Lattmann, S., Rhodes, D., Yan, J. RHAU helicase stabilizes G4 in its nucleotide-free state and destabilizes G4 upon ATP hydrolysis. Nucleic Acids Res. 45 (1), 206-214 (2017).
  14. You, H., et al. Dynamics and stability of polymorphic human telomeric G-quadruplex under tension. Nucleic Acids Res. 42 (13), 8789-8795 (2014).
  15. Fu, H., Chen, H., Marko, J. F., Yan, J. Two distinct overstretched DNA states. Nucleic Acids Res. 38 (16), 5594-5600 (2010).
  16. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophys. J. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  17. Fu, H., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  18. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  19. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  20. Chen, H., et al. Improved High-Force Magnetic Tweezers for Stretching and Refolding of Proteins and Short DNA. Biophys. J. 100 (2), 517-523 (2011).
  21. Fu, H. X., et al. Transition dynamics and selection of the distinct S-DNA and strand unpeeling modes of double helix overstretching. Nucleic Acids Res. 39 (8), 3473-3481 (2011).
  22. Zhang, X., Chen, H., Fu, H., Doyle, P. S., Yan, J. Two distinct overstretched DNA structures revealed by single-molecule thermodynamics measurements. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (21), 8103-8108 (2012).
  23. Zhang, X., et al. Revealing the competition between peeled ssDNA, melting bubbles, and S-DNA during DNA overstretching by single-molecule calorimetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (10), 3865-3870 (2013).
  24. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  25. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  26. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annu Rev Biophys. 41, 453-472 (2012).
  27. Yan, J., Skoko, D., Marko, J. F. Near-field-magnetic-tweezer manipulation of single DNA molecules. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 70 (1 Pt 1), 011905 (2004).
  28. Le, S., et al. Disturbance-free rapid solution exchange for magnetic tweezers single-molecule studies. Nucleic Acids Res. 43 (17), e113 (2015).
  29. Neidle, S. Quadruplex Nucleic Acids as Novel Therapeutic Targets. J Med Chem. 59 (13), 5987-6011 (2016).
  30. Simone, R., Fratta, P., Neidle, S., Parkinson, G. N., Isaacs, A. M. G-quadruplexes: Emerging roles in neurodegenerative diseases and the non-coding transcriptome. FEBS Lett. 589 (14), 1653-1668 (2015).
  31. Balasubramanian, S., Hurley, L. H., Neidle, S. Targeting G-quadruplexes in gene promoters: a novel anticancer strategy?. Nat Rev Drug Discov. 10 (4), 261-275 (2011).
  32. Amato, J., et al. Toward the Development of Specific G-Quadruplex Binders: Synthesis, Biophysical, and Biological Studies of New Hydrazone Derivatives. J Med Chem. 59 (12), 5706-5720 (2016).
  33. Wells, R. D. Non-B DNA conformations, mutagenesis and disease. Trends Biochem Sci. 32 (6), 271-278 (2007).

Tags

G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image