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Biochemie

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Published: September 19, 2017
doi:
10.3791/56328
, , , ,
1School of Pharmacy, Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, 2Mechanobiology Institute,National University of Singapore, 3Department of Physics,National University of Singapore, 4Research Institute for Biomimetics and Soft Matter, Fujian Provincial Key Lab for Soft Functional Materials Research, Department of Physics,Xiamen University, 5Center for Bioimaging Sciences,National University of Singapore

Summary

Eine magnetische Pinzette Einzelmolekül-Plattform, G-Quadruplexe zu manipulieren wird berichtet was ermöglicht das Studium der G4 Stabilität und Verordnung durch verschiedene Proteine.

Abstract

Nicht-kanonische Nukleinsäure-Sekundärstruktur, die G-Quadruplexe (G4) in verschiedenen zellulären Prozessen, wie DNA-Replikation, Transkription, RNS-Verarbeitung und Telomere Dehnung beteiligt sind. Während dieser Prozesse verschiedener Proteine binden und lösen G4 Strukturen, ihre Funktion auszuführen. Da die Funktion des G4 oft auf die Stabilität der gefaltete Struktur abhängt, ist es wichtig zu untersuchen, wie G4-bindende Proteine regulieren die Stabilität des G4. Dieses Werk stellt eine Methode zum manipulieren G4 Einzelmoleküle magnetischen Pinzette, die Studien über die Regulierung der G4-bindende Proteine auf ein einzelnes Molekül der G4 in Echtzeit ermöglicht. Im Allgemeinen ist diese Methode geeignet für ein breites Spektrum von Anwendungen in Studien für Proteine/Liganden Interaktionen und Vorschriften auf verschiedenen DNA- oder RNA-Sekundärstrukturen.

Introduction

Vier-Stranded DNA oder RNA G4 Strukturen spielen wichtige Rollen in viele wichtige biologische Prozesse1. Viele Proteine beteiligt sind G4 Bindung und Verordnung, einschließlich der Telomer-bindende Proteine (Telomerase, POT1, RPA, TEBPs, TRF2)1,2, Transkriptionsfaktoren (Nucleolin, PARP1)3, RNA, Proteine (HnRNP A1, Verarbeitung HnRNP A2)4, Helicases (BLM, FANCJ, RHAU, WRN, Dna2, Pif1)5und DNA-Replikation im Zusammenhang mit Proteinen (Rif1, REV1, PrimPolymerase)6. Proteinbindung kann stabilisieren oder destabilisieren G4 Strukturen; so regelt die nachfolgende biologische Funktionen. Die Stabilität des G4 wurde durch thermische schmelzen mit Ultraviolett (UV) oder kreisförmigen Dichroismus (CD) Methoden7gemessen. Solche Bedingungen sind jedoch nicht physiologischen relevant und sind schwierig, die Auswirkungen der verbindlichen Proteine7anzuwenden.

Die rasante Entwicklung im Einzelmolekül-Manipulation Technologien hat Studien von Falten und entfalten von ein Biomolekül, wie eine DNA oder ein Protein Einzelmolekül-Ebene mit Nanometer-Auflösung in Echtzeit8aktiviert. Rasterkraftmikroskopie (AFM), optische Pinzette und magnetischen Pinzette sind die am häufigsten verwendeten Methoden der Einzelmolekül-Manipulation. Im Vergleich zu AFM und optische Pinzette9, ermöglichen magnetischen Pinzette stabile Messungen der Faltung entfaltet Dynamik eines einzelnen Moleküls über Tage mithilfe einer Anti-Drift-Technik10,11.

Hier ist eine Einzelmolekül-Manipulation-Plattform magnetischen Pinzette, um die Regulierung der G4 Stabilität zu studieren, durch die Bindung von Proteinen gemeldeten12,13. Diese Arbeit beschreibt die grundlegenden Ansätze, einschließlich Probe und Flow-Kanal-Vorbereitung, das Setup der magnetischen Pinzette und die Kraft-Kalibrierung. Die Kraftregelung und die Anti-Drift-Protokolle wie beschrieben in Schritt 3 ermöglichen lange Zeitmessungen unter verschiedenen Kraft Steuerelemente, z. B. konstante Kraft (Kraft Klemme) und konstante laden bewerten (Kraft-Rampe) und Kraft-Sprung Messung. Das Kraft-Kalibrierung-Protokoll in Schritt 4 beschriebenen ermöglicht Kraft Kalibrierung des < 1 µm kurze Anbindehaltung über eine große Kraft reichen bis zu 100 pN, mit einem relativen Fehler innerhalb von 10 %. Ein Beispiel für eine Regulierung der Stabilität der RNA-Helikase zugeordnete AU-reiche Element (RHAU) Helikase (Alias DHX36, G4R1), der spielt entscheidende Rolle bei der Lösung, dass RNA G4 verwendet wird, um die Anwendungen von dieser Plattform13demonstrieren.

Protocol

1. Vorbereitung der G4 DNA Einzelmolekül-Stretching Prepare 5 '-Thiol beschriftet und 5 '-Biotin beschriftet DsDNA Griffe durch PCR mit DDNA Polymerase auf einen Lambda-Phagen DNA Schablone mit 5 '-Thiol und 5 '-Biotin Primer 14 ( Abbildung 1). Beide DsDNA-Griffe haben hohen GC-Gehalt (> 60 %), um DNA zu verhindern schmelzen wenn DNA zu hohen Kräften oder während DNA Überdehnung stattfindet Übergang 15.</li…

Representative Results

Die Testeinrichtung für die Dehnung eines einzelnen Moleküls G4 ist in Abbildung 4dargestellt. Eine einsträngige G4 bildende Sequenz erstreckte sich zwischen zwei DsDNA Griffe war zwischen einem Deckgläschen und einem paramagnetischen Perle angebunden. Um eine einzelne DsDNA gefesselte Perle zu finden, wurde ein overstretching Assay durchgeführt, durch die Erhöhung der Kraft bei konstanter Belastung. Drei Arten von Messungen dienten oft zur Untersuchung…

Discussion

Einzelmolekül-magnetischen Pinzette wird berichtet, wie beschrieben, eine Plattform für die Untersuchung der mechanischen Stabilität der G4-DNA und die Interaktionen von Proteinen mit G4. Begleiten die Plattform, sind hocheffiziente Protokolle zu finden, G4-DNA Haltegurt und Messung der Faltung entfaltet Dynamik und Stabilität der G4-Struktur mit Nanometer Sonderbeschluss entwickelt. Die Brennebene Verriegelung ermöglicht hochstabile Anti-Drift-Steuerelement, das ist wichtig für die Erkennung eines kleinen Struktur…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Meng Pan für Korrekturlesen Manuskript. Diese Arbeit wird von Singapur Ministerium der Ausbildung akademische Forschung Fonds Stufe 3 (MOE2012-T3-1-001), J.Y unterstützt; der National Research Foundation über das Mechanobiology Institut Singapur, J.Y; der National Research Foundation, des Premierministers Büro, Singapur, unter seinem NRF Investigatorship Programm (NRF Investigatorship Award Nr. 03 / NRFI2016 / NRF, J.Y; die Grundlagenforschung Fonds für den Central-Universitäten (2017KFYXJJ153), H. Y.

Materials

DNA PCR primers IDT DNA preparations
DNA PCR chemicals NEB DNA preparations
restriction enzyme BstXI NEB R0113S DNA preparations
coverslips (#1.5, 22*32 mm, and 20*20 mm) BMH.BIOMEDIA 72204 flow channel preparation
Decon90 Decon Laboratories Limited flow channel preparation
APTES Sigma 440140-500ML flow channel preparation
Sulfo-SMCC ThermoFisher Scientific 22322 flow channel preparation
M-280, paramganetic beads,streptavidin ThermoFisher Scientific 11205D flow channel preparation
Polybead Amino Microspheres 3.00 μm Polysciences, Inc 17145-5 flow channel preparation
2-Mercaptoethanol Sigma M6250-250ML flow channel preparation
Olympus Microscopes IX71 Olympus IX71 Magnetic tweezers setup
Piezo-Z Stages P-721 Physik Instrumente P-721 Magnetic tweezers setup
Olympus Objective lense MPLAPON-Oil 100X Olympus MPLAPON-Oil 100X Magnetic tweezers setup
CCD/CMOS camera AVT Pike F-032B Magnetic tweezers setup
Translation linear stage Physik Instrumente MoCo DC Magnetic tweezers setup
LED Thorlabs MCWHL Magnetic tweezers setup
Cubic Magnets Supermagnete Magnetic tweezers setup
Labview National Instruments Magnetic tweezers setup
OriginPro/Matlab OriginLab/MathWorks Data analysis
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G-quadruplexMagnetic TweezersSingle-molecule ManipulationFolding And UnfoldingBinding ProteinsDNA-protein InteractionsHelicase ActivityDNA Tether FormationParamagnetic BeadsNanometer-scale Dynamics

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You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers. J. Vis. Exp. (127), e56328, doi:10.3791/56328 (2017).
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