JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Krebsforschung

MicroRNA gebaseerde vloeibare biopsie: De ervaring van de Plasma miRNA handtekening classificatie (MSC) voor Lung Cancer Screening

Published: October 26, 2017
doi:
10.3791/56326
, , , , , , , ,
1Department of Experimental Oncology and Molecular Medicine,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, 2Unit of Thoracic Surgery,Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori

Summary

Hier presenteren we het gedetailleerde protocol vastgesteld in de BioMILD screening proces de circulerende microRNA handtekening classificatie als test wilt uitvoeren voor de vroegtijdige opsporing van long kanker.

Abstract

De ontwikkeling van een minimaal invasieve test, zoals vloeibare biopsie, voor de vroegtijdige opsporing van longkanker-kanker in de preklinische fase is cruciaal voor het verbeteren van het resultaat van deze dodelijke ziekte. MicroRNAs (miRNAs) zijn specifieke, kleine, niet-coderende RNAs regulering van de expressie van genen, die als extracellulaire boodschappers van biologische signalen fungeren kan afkomstig van de cross-talk tussen de tumor en de omliggende communicatie weefsel. Ze kunnen dus ideale kandidaten voor de vroegtijdige opsporing van longkanker betekenen. In dit werk, wordt een methodologische workflow voor de potentiële validatie van een circulerende miRNA test met behulp van aangepaste gemaakte microfluidic kaarten en kwantitatieve Real-Time PCR in plasma monsters van vrijwilligers die zijn ingeschreven in een longkanker screening proces voorgesteld. Bovendien, aangezien de release van hemolyse-gerelateerde miRNAs en de meer algemene technische vraagstukken gevolgen voor de analyse hebben kan, worden de stappen van de kwaliteitscontrole in de standaardwerkvoorschriften opgenomen ook gepresenteerd. Het protocol is reproduceerbaar en geeft betrouwbare kwantitatieve resultaten; echter bij het gebruik van grote klinische serie, moeten zowel vooraf analytische en analytische functies voorzichtig behandeld worden.

Introduction

Longkanker is de meest algemeen diagnose kanker wereldwijd, goed voor ongeveer 25% van alle kanker diagnoses1. Ondanks de gestage vermindering van long kanker sterfte in de afgelopen 2 decennia, voornamelijk als gevolg van de verminderde tabaksgebruik, blijft longkanker de belangrijkste oorzaak van kanker overlijden bij zowel mannen als vrouwen. In 2017, is het account voor ongeveer 25% en 20% van de totale kankersterfgevallen in de Verenigde Staten en Europa, respectievelijk1,2voorspeld.

Aangezien de symptomen meestal niet in het beginstadium van de ziekte te voorkomen, zijn de meerderheid van de longkankerziekten gediagnosticeerd bij late stadia. Dit leidt tot een beperkte mogelijkheid voor therapeutische interventie en arme werkzaamheid van de behandelingen3. Daarom zijn veel wetenschappelijke inspanningen gericht op het identificeren van een effectieve test voor opsporing van longkanker-kanker.

Een verscheidenheid van het screenen van de proeven blijkt dat borst radiografie geen waarde in Long kankerscreening heeft, overwegende dat lage dosis berekend tomografie (LDCT) is een beter instrument ten opzichte van radiografie voor het opsporen van vroege stadium longkanker-kanker4. Bovendien heeft het aangetoond thatscreening met het gebruik van LDCT verminderde long kanker sterfte onder huidige en voormalige zware rokers5tot 20%. Deze gegevens ondersteunen het gebruik van Long kankerscreening in een hoog risico populatie als omschreven in de richtsnoeren door verschillende professionele samenlevingen4,6.

Van de nota, onder de grote zorgen over LDCT screening, is er het hoge tempo van vals-positieve resultaten en de overmatige diagnose. Dat daarom de wetenschappelijke gemeenschap is op zoek naar een strategie voor het overwinnen van deze problemen en verhogen van de specificiteit van de screeningtest LDCT. De ontwikkeling van niet-invasieve complementaire biomarkers zou kunnen hier nuttig zijn. Tot op heden is er een uitgebreide lijst van kandidaat-biomarkers onderzochte, zoals miRNAs, cel-gratis DNA, gene methylering, kleine eiwitten en anderen7.

Bloed gebaseerde biomarkers, met inbegrip van de immuunrespons biomarkers en circulerende miRNAs, zijn die de meer geavanceerde validatie fase8bereiken. De immuunrespons biomarkers zijn gebaseerd op de wetenschap dat immuunrespons tegen beide intracellulaire en oppervlakte tumor-antigenen zijn opgebouwd in long kanker patiënten9. Bijvoorbeeld, Ajona et al. de rol van C4d, een afbraakproduct van de klassieke complement pathway, in de diagnose en prognose van long kanker10geëvalueerd. Anders, een serum verkrijgbare autoantilichamen testen zeven tumor-gerelateerde antigenen is gevalideerd in niet-kleincellige longkanker kankerpatiënten en bleek 36% van gevoeligheid en 91% van specificiteit11te onderzoeken. Immuunrespons biomarkers zijn interessant, maar verdere validatie studies zijn nodig voor een potentiële klinische toepassing.

miRNAs zijn endogene kleine niet-coderende RNAs met een geconserveerde mechanisme en grote functionele betekenis overal de koninkrijken van dier- en plantensoorten. De rol van miRNAs is het reguleren van eiwit vertaling: ze onderdrukken de expressie van een groot aantal doel genen12. Het is goed gedocumenteerd dat wijzigingen ofmiRNAs expressie aan de pathogenese van de meeste menselijke kanker12,–13,14 bijdragen. Daarnaast vrij zowel tumor en stromale cellen miRNAs, gestabiliseerd door hun opneming in de microvesicles of via deelname aan RNA-bindende proteïnen, in lichaamsvloeistoffen zoals plasma en serum15,16, urine17 , en speeksel18. Circulerende miRNAs kan dus de reactie van de gastheer en de dynamische interactie tussen de tumor en de communicatie19weerspiegelen. Tezamen hebben deze opmerkingen gemaakt circulerende miRNAs een veelbelovende klasse van biomarkers voor het opsporen van menselijke kanker.

Circulerende miRNAs kan worden opgespoord met behulp van verschillende methoden: microarray platforms20, kwantitatief reverse transcriptie PCR (RT-qPCR)21, en de volgende generatie sequencing (NGS)-14,22. Diverse expressie profiel studies op basis van de bovengenoemde technologieën zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren. Microarray is een high-throughput technologie, kunnen analyseren tot duizenden miRNAs in één enkele test. Nochtans, heeft het lagere dynamisch bereik en specificiteit ten opzichte van RT-qPCR of NGS. Bovendien, microarray is een niet-kwantitatieve methode, dus verdere experimentele validatie is vereist. Reeks gebaseerde methoden kunnen de identificatie van onbekende miRNAs en zijn geschikt vooral in een fase van de ontdekking. Aan de andere kant, NGS methoden zijn nog steeds duur en vereist speciale uitrustingen en deskundige bioinformaticians, dus het beperken van het gebruik ervan in grote validatie cohorten en klinische instellingen23. RT-qPCR is op dit moment het meest aangenomen platform voor het circuleren van miRNA detectie in een diagnose/klinische context24. Er zijn verschillende technologieën van de RT-qPCR beschikbaar voor miRNAs analyse, maar de stam-lus RT gevolgd door TaqMan PCR is de wijdst gebruikte25. Deze techniek is uiterst gevoelig en nauwkeurig (single nucleotide discriminatie) en heeft een hoog dynamisch bereik; echter, het kan de detectie van bekende miRNAs alleen.

De kwaliteitscontrole microRNA studie (miRQC-studie) door Mestdagh et al. uitgebreid onderzocht op de kenmerken van sommige commercieel beschikbare platforms voor miRNAs profileren op basis van de drie voornoemde technologieën26. Door het analyseren van 196 miRNAs in weefsels en serummonsters, werden de prestaties van de verschillende platformen beoordeeld in termen van reproduceerbaarheid, gevoeligheid, specificiteit, nauwkeurigheid en concordantie van differentiële expressie. De resultaten hebben aangetoond dat platformen gebaseerd op NGS en technologieën van microarray een hogere reproduceerbaarheid en specificiteit hadden, maar RT-qPCR platformen waren nauwkeuriger, gevoelige, en had een hoger opsporingspercentage, speciaal voor lage input RNA monsters, zoals lichaam vloeistoffen. RT-qPCR lijkt dus de meest geschikte methode voor een mogelijke toepassing in de routine klinische diagnostiek.

In 2011, Sozzi et al. geanalyseerd de miRNA-Profiel van plasma monsters verzameld van vrijwilligers die zijn ingeschreven in een eerste LDCT screeningtrial (INT-OIE proef)27 en vier miRNA handtekeningen gecomponeerd door wederzijdse verhoudingen tussen 24 circulerende miRNAs werden gegenereerd. Deze handtekeningen zijn kundig voor ziekte vrij individuen van patiënten met een discrimineren of dodelijke longkanker tijd of maximaal 2 jaar voordat LDCT ziekte detectie28. In een verdere papier, dezelfde groep beschreven voor de eerste keer de miRNA handtekening classificatie (MSC), verkregen door de combinatie van de vier miRNA handtekeningen te stratificeren patiënten in drie niveaus van risico: lage, hoge en intermediair. Het klinisch nut ervan werd gevalideerd in een grote retrospectieve set van meer dan 1.000 personen ingeschreven in het MILDE screening-proces, een gerandomiseerde studie vergelijken jaarlijkse of tweejaarlijkse LDCT armen met een observatie arm29. Inderdaad, de combinatie van MSC en LDCT verlaagd de LDCT vals-positieve door ongeveer 5 keer en de drie MSC-risicogroepen warentotale overleving is gekoppeld.

Later, in 2013 op de “Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori’ (Milaan, het) een prospectieve screening trial (BioMILD) uitvoering van LDCT met de plasma gebaseerde MSC test werd gelanceerd. Vrijwilligers die zijn ingeschreven in het BioMILD proces ondergaan LDCT en bloed terugtrekking die onmiddellijk wordt verwerkt om te scheiden van plasma voor miRNA profielen met behulp van aangepaste gemaakte microfluidic kaarten. De combinatie van de LDCT en MSC resultaten definieert de specifieke algoritme24screening.

In het huidige werk, de hele methodologische protocol dat wordt gebruikt in het BioMILD-proces wordt beschreven, vanaf samples van bloed, plasma isolement, RNA extractie, en de 24 miRNAs expressie profilering met behulp van aangepaste maakte RT-qPCR microfluidic kaarten. Gezien de hoge consistentie en reproduceerbaarheid, kunnen deze procedures ook worden gebruikt voor de ontwikkeling van miRNA gebaseerde vloeibare biopsieën in andere ziekten.

Protocol

het protocol is goedgekeurd door de ethische commissie van onderzoek van onze instelling. 1. plasma Sample collectie verzamelen 10 mL bloed monster in Vacutainer buizen spray beklede K 2 EDTA en bewaar bij kamertemperatuur. Opmerking: Om te minimaliseren de hemolyse, scheiden plasma binnen 2 uur. Bewaar niet de volbloed bij lage temperatuur (dat wil zeggen, 4 ° C) om te voorkomen van thermische schok en cel lysis die leiden tot een aspecifieke miRNA release. Binnen 1 h, scheiden de plasma door een eerste stap van het centrifugeren op 1258 x g- en 4 ° C gedurende 10 minuten Breng het plasma supernatant in een tube van 15 mL, zorgvuldig het vermijden van contact met de lymfatische ring. Centrifugeer het plasma een tweede keer bij 1,258 x g en 4 ° C gedurende 10 minuten Plasma in 1,5 mL cryovials, het vermijden van het verzamelen van de plasma-breuk aan de onderkant van de buis aliquoot 1 mL. Slaan alle aliquots bij − 80 ° C, met uitzondering van één voor de evaluatie van de hemolyse. De moleculaire analyse moet worden uitgevoerd binnen 5 weken. 2. Evaluatie van hemolyse door spectrofotometrische meting direct nadat de plasma scheiding stap, in een cuvet voor spectrofotometrie, een 1:10 verdunning van het plasma monster in 1 X PBS (bijvoorbeeld, 100 µL van plasma in 900 µL van 1 X PBS) en mix te homogeniseren it. Opmerking: Het plasma monster moet niet worden bevroren voordat de spectrofotometrische meting, als het bevriezen-ontdooien van het monster (en in het bijzonder in monsters van lipemic), kunnen vormen flocculates die met de spectrofotometrische analyse interfereren. Lees de absorptie bij 375 nm, 414 nm, 541 nm en 576 nm in een spectrofotometer UV-Vis, met een correctie van de basislijn geregeld bij 750 nm en een weglengte van 10 mm. een lege meting met behulp van 1 mL 1 x PBS uitvoeren. Berekenen van de verhouding tussen de absorptie bij 414 nm en 375 nm; indien hoger dan 1,4, overwegen het monster hemolyzed en herhaal de terugtrekking van het bloed (QC1 in tabel 1). 3. Plasma totaal RNA extractie voorbereiden een 1-Thioglycerol/homogenisering (OMG)-oplossing met 20 µL van 1-Thioglycerol per mL homogenisering oplossing. Sinds 1-Thioglycerol is een viskeuze, zorgvuldig Pipetteer voor nauwkeurige meting. Chill de OMG oplossing op ijs of op 2-10 ° C alvorens het te gebruiken it Opmerking: De werkoplossing is stabiel bij 2-10 ° C gedurende 1 maand. Schorten de gelyofiliseerd DNase ik door toevoeging van 275 µL van nuclease-gratis water in het flesje en voorzichtig mengen (doen niet vortex). Als een visueel hulpmiddel, voeg 5 µL van blauwe kleurstof om het gereconstitueerde DNase ik en afzien van de oplossing in eenmalig gebruik aliquots in nuclease-vrije buizen. Opslaan van gereconstitueerde DNase ik bij-30 ° C tot -10 ° C. Vanaf 200 µL van plasma, voeg 200 µL van de gekoelde OMG oplossing. Vortex 15-30-s om een volledige homogenisering. Als er schuimvorming optreedt, laat het monster vestigen op ice. Voeg toe 200 µL van Lysis Buffer en 25 µL van proteïnase K aan het gehomogeniseerde monster en de vortex voor 20 s. Incubate de monsters gedurende 15 min. in een thermomixer voorverwarmd bij 37 ° C. Laden van een cartridge voor elk monster op de dek-lade van het instrument en de plugger in de juiste positie plaatsen. De lysate overbrengen naar de juiste positie in de cartridge instrument. Toevoegen 5 µL van DNase ik oplossing naar de juiste positie in de cartridge. Toevoegen 60 µL van nuclease-vrij water aan de basis van elke buis elutie. Selecteer de " RSC miRNA weefsel " methode en beginnen de automatische reiniging uitvoeren. De totale RNA monsters kunnen worden achtergelaten bij − 80 ° C. 4. RT Taq gebaseerde het Taq RT Primer zwembad gebruiken met de miRNAs van belang om te converteren van het RNA naar cDNA met de Taq MicroRNA Reverse transcriptie Kit. Bereiden 12 µL van RT reactie mix op ijs in een tube microcentrifuge 1,5 mL volgens de instructies van de kit, met behulp van 6 µL van het aangepaste Taq RT Primer zwembad. Voeg 3 µL van totaal RNA voor een eindvolume van 15 µL en incubeer in ijs gedurende 5 minuten Laden de RT-reactie op een thermo-cycler als volgt geconfigureerd: 16 ° C gedurende 30 min, 42 ° C gedurende 30 minuten, 85 ° C gedurende 5 minuten en wachtruimte tegelijk 4 ° C. Opmerking: De cDNA kunnen bewaren bij -15 tot-20 ° C gedurende ten minste één week. 5. Versterking van de pre Mix 2.5 µL van elk product RT met 12,5 µL van Taq Master Mix 2 x 3,75 µL aangepaste Taq zwembad en 6,25 µL nuclease-gratis water, voor een totaal volume van 25 µL. Voeren de reactie van de pre versterking met behulp van een thermo-cycler volgens het volgende thermische profiel: 95 ° C gedurende 10 min, 55 ° C gedurende 2 minuten, 72 ° C gedurende 2 minuten, 12 cycli van 95 ° C voor 15 s, en 60 ° C gedurende 4 minuten , houd vervolgens bij 99,9 ° C gedurende 10 minuten en bij 4 ° C. Het product verdunnen door toevoeging van 175 µL van 0.1 X TE, pH 8,0. Opmerking: Het verdunde product kunnen bewaren bij -15 tot-20 ° C gedurende ten minste één week. 6. RT-qPCR reactie op aangepaste Taq Array MicroRNA kaarten Gebruik de 384-well microfluidicCustom Taq Array MicroRNA Card voor het meten van plasma niveaus van de 24 specifieke miRNAs (gespot in tweevoud) op 8 monsters tegelijk. MiRBase ID (v21) voor de 24 miRNAs zijn: heeft-miR-101-3 p, heeft-miR-106a – 5p, heeft-miR-126-3 p, heeft-miR-133a – 3p, heeft-miR-140-3 p, heeft-miR-140-5 p, heeft-miR-142-3 p, heeft-miR-145-5 p, heeft-miR-148b – 3p, heeft-miR-15b – 5p, heeft-miR-16-5 p, heeft-miR-17-5-p, heeft-miR-197-3 p, heeft-miR-19b – 3p, heeft-miR-21-5 p, heeft-miR-221-3 p, heeft-miR-28-3 p, heeft-miR-30b – 5p, heeft-miR – 30c – 5p, heeft-miR-320a, heeft-miR-451a, heeft-miR-486-5 p, heeft-miR-660-5 p, en heeft-miR-92a – 3p. Mix 1.13 µL van het verdunde monster PreAmp met 56.25 µL van 2 X Taq universele Master Mix en 55.69 µL van nuclease-gratis water in een tube van 0,5 mL. Tot 8 PCR reactie mix op de aangepaste Taq Array MicroRNA kaarten laden. Centrifugeer bij 311 x g gedurende 2 min. Zegel van de aangepaste kaart met de matrix kaart sealer. Lopen de Real-Time reactie met behulp van een Real-Time PCR-systeem aan te passen de fietsen parameters gevolgd: 94,5 ° C gedurende 10 min, 40 cycli van 97 ° C voor 30 s en 59.7 ° C gedurende 60 s. 7. Extrapolatie van de gegevens en ratio’s generatie gebruik van de software om raw Ct waarden, het instellen van een automatische basislijn te verwijderen van de achtergrond-signalen en een vaste drempelwaarde van 0,15 voor alle testen en monsters te verkrijgen. Verwijderen van vlekken met slechte amplificatie curven en/of slechte passieve referentie signalen. Export van ruwe Ct waarden in " .xls " opmaken en de waarde van Ct betekenen van de twee dubbels gebruiken voor verdere analyse. Correlaat miRNAs ' expressie niveaus naar historische maten op klinisch onderzoek monsters (Tabel 2). Als ten minste 50% van de monsters op de kaart van elke aangepaste gemaakte microfluidic in een Pearson resulteren ' s correlatie < 97,5, herhaal de kaart (QC2 in tabel 1). Berekenen de − ΔCts tussen alle miRNAs, overeen met de waarden van de log2 van de verhoudingen van de miRNA. 8. Evaluatie van hemolyse door de verwante miRNA handtekening genereren de hemolyse-gerelateerde miRNA handtekening met behulp van de volgende miRNA verhoudingen met de respectieve cut-offs (log2 waarden) voor korte opslag plasma monsters (1-5 weken op − 80 ° C): miR-126/451 < − 0.07, 15b/451 < − 3.67, 221/451 < − 3.18, 30b/451 < − 1.1, 126/486-5p < − 0.33, 15b/486-5 p < − 3.86, 221/486-5 p < − 3,17, 30b/486-5 p < − 1.42, 126/92a < 1.8, 15b/92a < − 1.8, 221/92a < − 1.04, 30b/92a < 0.87, 126/16 < − 2,85, 15b/16 < − 6.33, 221/16 < − 5.9, 30b/16 < − 3,68. Classify als hemolyzed monsters waar ten minste 50% van de verhoudingen (8 van 16) hoger zijn dan de respectieve cut-off (QC3 in tabel 1). 9. Definitie van het niveau van risico: hoog, intermediair en lage definiëren de vier handtekeningen van miRNA ratio’s samenstellen van de MSC, zoals vermeld in Figuur 3: risico van ziekte (RD), risico van agressieve ziekte (RAD), aanwezigheid van ziekte (PD), en de aanwezigheid van agressieve ziekte (PAD). Voor elke handtekening, definiëren de ratio’s meer dan de waarde van de respectieve cut-off voor korte opslag plasma monsters (1-5 weken op − 80 ° C). Het aantal van de hoogste ratio’s moesten worden als positief beschouwd is 9 van de 27 voor RD en PD, en 14 van 28 voor RAD en PAD ( Figuur 3 A). Toeschrijven aan elk monster de respectieve MSC risiconiveau als volgt: een laag risico als RD neg ∩ PD neg ∩ RAD neg ∩ PAD neg; intermediair risico als RD pos ∪ PD pos ∩ RAD NEG ∩ PAD neg; of een hoog risico als RAD pos ∪ PAD pos ( Figuur 3 B).

Representative Results

Het BioMILD-proces is een prospectieve studie voor de vroegtijdige opsporing van longkanker met als doel het testen van de efficiëntie van een gecombineerde aanpak van de LDCT-MSC als eerstelijns screeningtests in een grote cohort van zware roker individuen. Een klasse van risico wordt toegeschreven aan elke vrijwilliger op basis van de miRNA-test, die resulteert in verhoudingen tussen 24 plasma circulerende miRNAs. Als grotendeels gerapporteerde30,31,32is hemolyse een kritieke kwestie voor de analyse van de circulerende miRNA, aangezien valse resultaten kunnen worden verkregen door een niet-specifieke vrijval van miRNAs door de bloedcellen. In de voorgestelde methodologische workflow, een vooraf analytische kwaliteitscontrole (QC1 in tabel 1) stap om te identificeren hemolyzed, en dus niet-analyseren, plasma monsters werd beschreven. Figuur 1 meldt een spectrofotometrische analyse van hemolyzed (Figuur 1A) en niet-hemolyzed (Figuur 1B) plasma monsters met de bijbehorende waarden van de A414/A375. In een klinische context waren het resultaat van een moleculaire test is van cruciaal belang voor het beheer van de vrijwilligers, deze QC1 kunnen de bloedmonsters herhalend is en, in de meeste gevallen, het herstel van het monster. Na moleculaire veredeling, moet de prestaties van de RT-qPCR nauwkeurig worden geëvalueerd om de technische problemen op te sporen. Figuur 2 A toont een RT-qPCR met een lage prestaties als gevolg van een slechte passieve referentie-signaal. In dit geval herladen de pre versterking-product op een nieuwe microfluidic wordt aanbevolen. Wanneer de RT-qPCR goed, zoals in Figuur 2B presteert, de kaart gaat door naar de eerste post analytische kwaliteitscontrole stap om ervoor te zorgen dat de miRNA expressie waarden vergelijkbaar met de historische meting zijn (QC2 in tabel 1). Als de QC2 stap mislukt, een technisch probleem kan hebben plaatsgevonden tijdens reverse transcriptie of in de versterking van de pre-reacties, en het is handig om het herhalen van de hele moleculaire verwerking vanaf omgekeerde transcriptie. De laatste stap van de kwaliteitscontrole (QC3 in tabel 1) evalueert de hemolyse ook op moleculair niveau. Expressie niveaus van 4 erytrocyt-specifieke miRNAs (mir-16, mir-451, mir-486-5 p en mir-92a) werden vergeleken met die van 4 niet-hemolyse verwante miRNAs (mir-126, mir-15b, mir-221 en mir-30b), het genereren van de hemolyse-gerelateerde miRNA handtekening gecomponeerd door de 16 (4 x 4) miRNA ratio’s. Positieve monsters worden geclassificeerd als hemolyzed, terwijl negatieve monsters overgaan tot de definitieve MSC risico niveau indeling als beschreven in punt 9 van Protocol en Figuur 3. Figuur 1: Spectrofotometrische analyse van vers plasma monsters. Spectrofotometrische profielen van (A) 2 hemolyzed en (B) 2 niet-hemolyzed plasma monsters, het meten van de Extinctieverhouding tussen golflengtes A414 en A375. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 2 : RT-qPCR prestaties in microfluidic kaarten analyse. Versterking en meervoudige percelen armen vergelijken (A) en (B) goede kwaliteit microfluidic kaarten. Alle 24 miRNAs en een enkele voorbeeldfunctie miRNA worden gemeld in elk deelvenster. De multicomponent percelen illustreren de passieve referentie signalen die zich voordoen bij deze RT-qPCR reacties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer. Figuur 3: MSC algoritme voor Risicostratificatie. Representatieve resultaten overweegt 6 plasma monsters van vrijwilligers ingeschreven in BioMILD screening trial. ()A) miRNA-ratio’s handtekeningen van risico van ziekte (RD), risico van agressieve ziekte (RAD), aanwezigheid van de ziekte (PD), aanwezigheid van agressieve ziekte (PAD), en licht-donkerscheiding tegenwaarde (log2) voor plasma monsters opgeslagen bij-80 ° C voor op ten minste 1 week en tot 5 weken. (B) de combinatie van de vier handtekeningen voor het stratificeren analyseren monsters in hoogte (H), intermediate (I) en lage (L) MSC risico niveau. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Valkuilen en uitdagingen van de methodologische Workflow
Als BioMILD de eerste verkennende studie circulerende miRNAs als een diagnostisch hulpprogramma analyseren is, drempels en cut-offs gebruikt voor data-analyse voortkomen uit retrospectieve serie. Om te overwinnen van de kwestie van de verschillende opslag-interval van plasma stalen, kunnen de parameters worden verfijnd om eventueel het verkrijgen van een stijging van de prestaties van de MSC. Toch, voordat u begint miRNAs analyse, verscheidene aspecten van het algehele proces moeten zorgvuldig worden geëvalueerd, zoals de inclusie criteria, het monster verzamelen en verwerken, en de bioinformatica algoritme aangenomen voor data-analyse. In de volgende secties zullen richten op de meest kritieke punten van de werkstroom die is beschreven in het huidige document, aanpak van de grote problemen van elke stap en vervolgens stelt strategieën om te overwinnen.

Studie bevolking
Inschrijving criteria voor de BioMILD screening trial: 50-75 jaar oude, zware huidige of voormalige (minder dan 10 jaar) rokers met ten minste 30 pack-jaar en geen voorafgaande geschiedenis van kanker binnen 5 jaar. In deze populatie waren de geschatte long kanker prevalentie en incidentie per jaar ongeveer 1% en 0,7%, respectievelijk. Oog op de toepassing van de MSC-test zoals beschreven in het voorgestelde protocol, moet de bevolking geanalyseerd vergelijkbare kenmerken behouden. De stap van de QC2 hierboven beschreven impliceert met name vergelijking met de bepaalde historische gegevens verkregen uit een soortgelijke populatie. Terwijl een correlatie hieronder 97,5 zou indicatief van technische problemen, aan de andere kant, zijn de meeste mensen met gewijzigde circulerende miRNA niveaus als gevolg van het risico van longkanker eigenlijk die drempel. Met andere woorden, als de stap van de QC2 met de parameters hier gemeld wordt toegepast op een inwoneraantal hoger risico op longkanker ontwikkelt, kan het aanvaardbaar monsters uitsluiten. Nieuwe, juiste verwijzing parameters moeten dan worden vastgesteld die specifiek voor elk volk volgens de verwachte resultaten geanalyseerd zijn.

Bloedinzameling en hemolyse
De collectie van biologische monsters is een cruciale vooraf analytische stap, omdat het kan afbreuk doen aan de kwaliteit van de steekproef en de kenmerken, en dus het wijzigen van de definitieve resultaten van de analyses. Met betrekking tot de bloedmonsters is het belangrijk te verzamelen van vers bloed en het model zo snel mogelijk verwerken. Monsters moeten worden bewaard bij 4 ° C noch bevroren na bloed terugtrekking, aangezien bevriezen en ontdooien passages lysis van de cel (hemolyse) en aantasting van het RNA kunnen veroorzaken. U wilt minimaliseren hemolyse proces, wordt voorgesteld om het scheiden van plasma binnen 2 uur van bloed collectie31 .

Hemolyse is grotendeels te wijten aan de afbraak van rode bloedcellen (RBC) en daaruit voortvloeiende release van hun inhoud in het omliggende milieu. Dit zou een probleem voor de circulerende miRNAs testen omdat release van RBC intracellulaire inhoud dramatisch het microRNA profiel in bloed verandert, potentieel op het gebied van de nauwkeurigheid van plasma-gebaseerde analyse30.

Kunnend identificeren ook minimumniveaus van hemolyse in plasma monsters is van cruciaal belang voor studies op basis van de circulerende miRNAs als biomarkers. Hemolyse kan in eerste instantie worden geëvalueerd door een visuele inspectie, sinds na de twee centrifugeren stappen die de kleur van plasma van geel tot rood voor zeer hemolyzed monsters variëren kan. Echter louter visuele inspectie mogelijk niet gevoelig genoeg is in de context van moleculaire biomerker onderzoek.

Een eenvoudige, vooraf analytische methode om te identificeren hemolyzed plasma monsters is de spectrofotometrische meting bij de golflengte (λ) = 414 nm van de belangrijkste oxyhemoglobin piek absorptie, na de juiste aanpassing voor elke andere bron van storing. Om die reden we genormaliseerd de 414 nm piek op de waarde van de extinctie op 375 nm, kenmerkend voor de lipidic inhoud33. Als alternatief, of beter, in combinatie, een lipemia-independenthemolysis (HS) score kunnen gebruikte34. Deze spectrophotometrically gebaseerde procedure kunt identificeren ten minste 6.1 mg/dL voor vrije hemoglobine. Anders kunnen hemolyzed exemplaren worden geïdentificeerd door middel van de opsporing van erytrocyt-specifieke miRNAs. Aangezien zelfs een zeer laag percentage van hemolyse een aanzienlijke toename van de erytrocyt-specifieke miRNA niveaus32ontlokken kan, Fortunato et al. geïdentificeerd een specifieke hemolyse-gerelateerde handtekening op basis van 16 miRNAs-ratio’s die efficiënt kunnen classificeren hemolyse in plasma monsters33. Alle genoemde tests kunnen worden gebruikt in combinatie sinds de Extinctieverhouding 414/375 en/of de HS worden aangenomen in een vooraf analytische fase verdere kostenbesparing, overwegende dat het meten van hemolyse-gerelateerde miRNAs kan worden gebruikt in een post analytische fase als een kwaliteitscontrole stap.

Circulerende miRNAs isolatie en RNA zuiverheid
De extractie van RNA-procedure is een zeer invloedrijke stap voor het welslagen van de latere analyses. Vanaf een lage input monster, zoals plasma, moet extractie zo efficiënt mogelijk te zijn om een nauwkeurige kwantificering van miRNAs. Plasma wordt gekenmerkt door hoge concentraties van veel eiwitten, met inbegrip van nucleasen, en andere onderdelen die stroomafwaarts enzymatische reacties van RT-qPCR kunnen verstoren en invloed kunnen hebben op de detectie van circulerende-miRNAs. Verschillende extractiemethoden in deze soorten studies zijn gebruikt, maar in het algemeen, organische extractie gevolgd door silica gebaseerde RNA verrijking kunt de verwijdering van plasma-remmers beter dan TRIzol alleen35. Niettemin, in de afgelopen jaren, manuele extractie is vervangen door geautomatiseerde extractie. Het geringe risico van verontreiniging, de hogere reproduceerbaarheid, en het gebruik van economische tijd zijn de belangrijkste voordelen van geautomatiseerde systemen ten opzichte van handmatige isolatie protocollen. Bovendien, geautomatiseerde extractiemethoden leverde de hoogste miRNA bedragen van bloedmonsters en de hoogste efficiëntie ten opzichte van handmatige protocollen36.

Normalisatie probleem
Normalisering van plasma miRNA niveaus is nog steeds een controversieel onderwerp. Inderdaad, verschillen in monster kwaliteit of kwantiteit kunnen interfereren met de identificatie van echte veranderingen in de miRNAs expressie niveaus veroorzaakt door de aanwezigheid of het risico van ziekten, en dus leiden tot dubbelzinnige gegevens interpretaties en misleidende conclusies. Tot nu toe heeft het gebrek aan consensus geleid tot diverse normalisatie strategieën37.

Totaal RNA geëxtraheerd uit plasma monsters is meestal onder de drempel van standaard kwantificering methoden zoals UV-spectrofotometrie of fluorescentie gebaseerde spectrofotometrie, aldus uitschakeling RNA massa normalisatie38. Bijgevolg moet een vast volume in plaats van een vast bedrag van geëlueerd RNA als input voor de RT reactie39worden gekozen.

Huishouden afschriften gebruikt voor de miRNA analyse van weefselmonsters, zijn zoals RNU48 en RNU6, niet geschikt voor het normaliseren van extracellulaire miRNA metingen, aangezien zij beide niet altijd opspoorbaar in omloop, als gevolg van aantasting van het RNase-gemedieerde40, en ook in een ziekte-specifieke wijze37worden gedereguleerd. Het is onduidelijk als een circulerende miRNAs effectief kan worden gebruikt als referentie controles. MiR-16 is bijvoorbeeld vaak voorgesteld voor het huishouden, maar dand studies hebben aangetoond dat het in plasma monsters van kanker patiënten28,37is geliberaliseerd. MiR-16 niveaus zijn bovendien zeer beïnvloed door hemolyse30.

Terwijl voor high-throughput testen meten verschillende miRNAs en normaliseren van de waarde van de gemiddelde expressie algemeen aanvaarde41, is wanneer een beperkt aantal miRNAs moet worden geanalyseerd, kan deze aanpak van de normalisatie kan niet worden toegepast. Om het omzeilen van het probleem van de normalisatie, vastgestelde Boeri et al. voorheen een algoritme gebaseerd op wederzijdse verhoudingen tussen 24 miRNAs28. Een dergelijke aanpak, ondanks het feit dat zeer nuttig is voor de ontwikkeling van het diagnostisch hulpprogramma, staat geen gemakkelijk onderscheiden effectief gewijzigd miRNAs die mogelijk een rol hebben in de ontwikkeling van de tumor, en dus het identificeren van miRNAs als werkende kalibratoren. Een andere effectieve strategie, overgenomen door de groep Bianchi et al. dat een serum miR-Test voor long kanker vroegtijdige opsporing ontwikkelde, was gebaseerd op het normaliseren van het meetkundige gemiddelde van een groep van 6 “huishouden serum-miRNAs” variëren minder onder monsters en klassen van patiënten42.

Kenmerken van miRNA gebaseerde vloeibare biopsie en potentiële toepassing
Plasma-gebaseerde MSC is een moleculaire niet-invasieve test studeerde voor vroegtijdige diagnose van longkanker bij zware rokers. De MSC-test kan de proefpersonen tussentijdse of met een hoog risico voor long kanker detectie door LDCT, met hoge gevoeligheid (SE, 87%) en negatief voorspellende waarde (NHW, 99%). In het bijzonder kan MSC LDCT screening uitvoeren door het verminderen van vals-positieve resultaten tot 3,7%, van 19,7% voor LDCT alleen29. De MSC-test is ook gebleken dat een goede prognostische prestaties bij het overwegen van enige Long kankerpatiënten, en kan worden gebruikt als een controle-instrument alleen of in combinatie met andere klinische pathologische parameters43,44. De MSC-test kunnen potentieel, grotere samenhang van long kanker Diagnostische algoritmen, dus dalende screening kosteneffectiviteit.

Naast de MSC, zijn andere niet-invasieve tests voor de opsporing van longkanker-kanker gemeld. Bianchi et al. voorgesteld een circulerende miR-Test op basis van een 34-miRNA handtekening45, waarna het tot een 13 miRNA handtekening42teruggebracht. Serum monsters fordiscovery en validatie zijn verkregen van de continue waarneming van rookvrije onderwerpen (kosmos) LDCT screening trial, uitgevoerd op het Europees Instituut voor Oncologie (IEO, Milaan, Italië). De miR-Test toonde 78% nauwkeurigheid voor long kanker detectie in risicovolle vrijwilligers. Tussen de 13 serum-miRNAs en het samenstellen van de MSC 24, waren slechts 5 miRNAs overlappende (miR-92a, miR-30b, miR – 30c, miR-148a en miR-140-5 p). Dit kan te wijten zijn aan de verschillende soorten monsters (serum vs. plasma) beginnen en uitwerking van de gegevens. In feite, voor de miR-Test waren de auteurs geselecteerde 6 miRNAs gedragen als huishouding in serum, waarvan 3 ook gerekend aan de MSC miRNA verhoudingen (miR-15b, miR-19b en miR-197). Niettemin, de MSC in plasma de miR-Test in serummonsters meer diep worden gevalideerd en het gebruik van miRNA gebaseerde vloeibare biopsie voor detectie van longkanker.

MiRNAs voor de identificatie van long kanker biomarkers profilering is ook verricht voor sputum monsters46. Sputum kan gemakkelijk worden verzameld en de miRNA expressie niveaus lijken te zijn in het uiterst stabiel. Echter, long kanker screening vrijwilligers zijn ouder dan 50-55 jaar en zware rokers met co-morbiditeit zoals COPD, waardoor sputum moeilijk te verkrijgen. Inderdaad, onder de verschillende lichaamsvloeistoffen, plasma is één van de beste alternatieven te onderzoeken van de potentiële rol van miRNAs als (maar niet beperkt tot) long kanker biomarkers.

Over het algemeen kunnen de procedure beschreven in het huidige document relevant in de context van verschillende ziekten, zonder beperking in de aard van de pathologie onderzocht (van kanker, zenuwstelsel en vaatziekten of diabetes) en het doel van klinisch gebruik (een biomarker voor diagnose, prognose, of zelfs reactie op behandeling).

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs bedanken Paola Suatoni, Elena Bertocchi, Carolina Ninni, Annamaria Calanca, en Chiara Banfi voor behandeling vrijwilligers bij de proeven en voor administratieve bijstand; en Claudio Jacomelli en Claudio Citterio voor gegevensbeheer. Het werk werd ondersteund door de Italiaanse vereniging voor kankeronderzoek [onderzoeker subsidies No. 15928 naar omhoog, 14318 GS en 12162 (speciaal programma “Innovatieve Tools for Cancer Risk Assessment and vroegtijdige diagnose”, 5 x 1000)]; het Italiaanse ministerie van volksgezondheid [Grant nr. RF-2010]; Grant UO1 CA166905 van het National Cancer Institute (Verenigde Staten). MB werd gesteund door een Fondazione Pezcoller Fellowship.

Materials

 1x PBS  Lonza BE-17-516
20xTE Buffer, pH 8.0 Molecular probe T11493 Dilute the 20X stock solution to have the final concentration of  0,1X in Nuclease-free water
Nuclease-free water 
Maxwell RSC miRNA Tissue Kit  Promega AS1460 The kit contains Homogenization Solution, DNase I, Proteinase K, Lysis Buffer and cartridges. For 1-Thioglycerol, inhalation and contact with skin and eyes should be avoided. Use it under a Fume Cabinet.
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit  Thermo Fisher 4366596
Custom TaqMan RT Primer Pool  Thermo Fisher 4459649
TaqMan PreAmp Master Mix 2X  Thermo Fisher 4391128
Custom TaqMan  PreAmp pool  Thermo Fisher 4459657
TaqMan Universal Master Mix II, No UNG 2x  Thermo Fisher 4440048
Custom TaqMan Array MicroRNA Cards  Thermo Fisher 4449137 Bring the Custom TaqMan Array MicroRNA Cards to room temperature before to load samples
Vacutainer Safety-Lock Blood Collection Set  Becton Dickinson 367286-364815
Vacutainer plastic spray-coated K2EDTA tube.  Becton Dickinson 366643 Lavender BD Hemogard closure 
Cuvette PS semi-micro  VWR/PBI  643-0326 Light path 10 mm
NanoDrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher
Cryogenic vials 1.5 ml  Sigma-Aldrich Z359033
Centrifuge 5810R  Eppendorf Bring the centrifuge to 4 °C before starting plasma collection
Heraeus Multifuge 3S+ Centrifuge Thermo Fisher D-37520
Vortex Mixer Velp Scientifica F202A0173
ThermoMixer T- shaker Euroclone  A00564 Bring the Thermo Mixer to 37 °C before starting RNA  extraction
Maxwell RSC Instrument Promega AS4500
GeneAmp PCR System 9700 thermo-cycler  Thermo Fisher
ViiA 7 Real-Time PCR System  Thermo Fisher
ViiA 7 RUO software  Thermo Fisher
Arrey Card Staker/Sealer Thermo Fisher 4331770
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Malvezzi, M., et al. European cancer mortality predictions for the year 2017, with focus on lung cancer. Ann Oncol. , 10 (2017).
  3. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (4), 271-289 (2016).
  4. Kanne, J. P. Screening for lung cancer: what have we learned. AJR Am. J Roentgenol. 202 (3), 530-535 (2014).
  5. Aberle, D. R., et al. Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med. 365 (5), 395-409 (2011).
  6. Wender, R., et al. American Cancer Society lung cancer screening guidelines. CA Cancer J Clin. 63 (2), 107-117 (2013).
  7. Molina-Vila, M. A., et al. Liquid Biopsy in Non-Small Cell Lung Cancer. Front Med (Lausanne). , 69 (2016).
  8. Sozzi, G., Boeri, M. Potential biomarkers for lung cancer screening. Transl Lung Cancer Res. 3 (3), 139-148 (2014).
  9. Shepherd, F. A., Douillard, J. Y., Blumenschein, G. R. Immunotherapy for non-small cell lung cancer: novel approaches to improve patient outcome. J Thorac Oncol. 6 (10), 1763-1773 (2011).
  10. Ajona, D., et al. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer. J Natl Cancer Inst. 105 (18), 1385-1393 (2013).
  11. Boyle, P., et al. Clinical validation of an autoantibody test for lung cancer. Ann Oncol. 22 (2), 383-389 (2011).
  12. Hayes, J., Peruzzi, P. P., Lawler, S. MicroRNAs in cancer: biomarkers, functions and therapy. Trends Mol Med. , (2014).
  13. Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat Rev Genet. 10 (10), 704-714 (2009).
  14. Iorio, M. V., Croce, C. M. MicroRNA dysregulation in cancer: diagnostics, monitoring and therapeutics. A comprehensive review. EMBO Mol Med. 4 (3), 143-159 (2012).
  15. Schwarzenbach, H., Nishida, N., Calin, G. A., Pantel, K. Clinical relevance of circulating cell-free microRNAs in cancer. Nat Rev Clin Oncol. 11 (3), 145-156 (2014).
  16. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10513-10518 (2008).
  17. Hanke, M., et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker: microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer. Urol Oncol. 28 (6), 655-661 (2010).
  18. Park, N. J., et al. Salivary microRNA: discovery, characterization, and clinical utility for oral cancer detection. Clin Cancer Res. 15 (17), 5473-5477 (2009).
  19. Boeri, M., Pastorino, U., Sozzi, G. Role of microRNAs in lung cancer: microRNA signatures in cancer prognosis. Cancer J. 18 (3), 268-274 (2012).
  20. Castoldi, M., et al. A sensitive array for microRNA expression profiling (miChip) based on locked nucleic acids (LNA). RNA. 12 (5), 913-920 (2006).
  21. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), 179 (2005).
  22. Schulte, J. H., et al. Deep sequencing reveals differential expression of microRNAs in favorable versus unfavorable neuroblastoma. Nucleic Acids Res. 38 (17), 5919-5928 (2010).
  23. Tiberio, P., Callari, M., Angeloni, V., Daidone, M. G., Appierto, V. Challenges in using circulating miRNAs as cancer biomarkers. Biomed Res Int. , 731479 (2015).
  24. Boeri, M., et al. Recent advances of microRNA-based molecular diagnostics to reduce false-positive lung cancer imaging. Expert Rev Mol Diagn. 15 (6), 801-813 (2015).
  25. Benes, V., Castoldi, M. Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available. Methods. 50 (4), 244-249 (2010).
  26. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  27. Pastorino, U., et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. Lancet. 362 (9384), 593-597 (2003).
  28. Boeri, M., et al. MicroRNA signatures in tissues and plasma predict development and prognosis of computed tomography detected lung cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3713-3718 (2011).
  29. Sozzi, G., et al. Clinical Utility of a Plasma-Based miRNA Signature Classifier Within Computed Tomography Lung Cancer Screening: A Correlative MILD Trial Study. J Clin Oncol. 32 (8), 768-773 (2014).
  30. Pritchard, C. C., et al. Blood cell origin of circulating microRNAs: a cautionary note for cancer biomarker studies. Cancer Prev Res (Phila). 5 (3), 492-497 (2012).
  31. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6 (9), 24145 (2011).
  32. Kirschner, M. B., et al. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4 (94), (2013).
  33. Fortunato, O., et al. Assessment of circulating microRNAs in plasma of lung cancer patients. Molecules. 19 (3), 3038-3054 (2014).
  34. Appierto, V., et al. A lipemia-independent NanoDrop((R))-based score to identify hemolysis in plasma and serum samples. Bioanalysis. 6 (9), 1215-1226 (2014).
  35. Kim, D. J., et al. Plasma components affect accuracy of circulating cancer-related microRNA quantitation. J Mol Diagn. 14 (1), 71-80 (2012).
  36. Kulstein, G., Marienfeld, R., Miltner, E., Wiegand, P. Automation of DNA and miRNA co-extraction for miRNA-based identification of human body fluids and tissues. Electrophoresis. 37 (21), 2742-2750 (2016).
  37. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data Normalization Strategies for MicroRNA Quantification. Clin Chem. 61 (11), 1333-1342 (2015).
  38. Schlosser, K., McIntyre, L. A., White, R. J., Stewart, D. J. Customized Internal Reference Controls for Improved Assessment of Circulating MicroRNAs in Disease. PLoS ONE. 10 (5), 0127443 (2015).
  39. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  40. Wang, K., et al. Comparing the MicroRNA spectrum between serum and plasma. PLoS One. 7 (7), 41561 (2012).
  41. Mestdagh, P., et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR data normalization. Genome Biol. 10 (6), 64 (2009).
  42. Montani, F., et al. miR-Test: A Blood Test for Lung Cancer Early Detection. J Natl Cancer Inst. 19 (6), 063 (2015).
  43. Sestini, S., et al. Circulating microRNA signature as liquid-biopsy to monitor lung cancer in low-dose computed tomography screening. Oncotarget. 20 (32), 32868-32877 (2015).
  44. Verri, C., et al. Mutational Profile from Targeted NGS Predicts Survival in LDCT Screening-Detected Lung Cancers. J Thorac. Oncol. (17), 10 (2017).
  45. Bianchi, F., et al. A serum circulating miRNA diagnostic test to identify asymptomatic high-risk individuals with early stage lung cancer. EMBO Mol Med. 3 (8), 495-503 (2011).
  46. Gyoba, J., Shan, S., Roa, W., Bedard, E. L. Diagnosing Lung Cancers through Examination of Micro-RNA Biomarkers in Blood, Plasma, Serum and Sputum: A Review and Summary of Current Literature. Int J Mol Sci. 17 (4), 494 (2016).

Tags

Liquid BiopsyPlasma MiRNALung Cancer ScreeningMicroRNA SignatureEarly DetectionTumor MicroenvironmentRNA IsolationQPCRMolecular Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Mensah, M., Borzi, C., Verri, C., Suatoni, P., Conte, D., Pastorino, U., Orazio, F., Sozzi, G., Boeri, M. MicroRNA Based Liquid Biopsy: The Experience of the Plasma miRNA Signature Classifier (MSC) for Lung Cancer Screening. J. Vis. Exp. (128), e56326, doi:10.3791/56326 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image