In Vitro Fagocitose de restos de mielina por macrófagos derivados de medula óssea
Summary
Apresentamos métodos para avaliar a capacidade fagocitária de primários macrófagos murino derivadas da medula óssea, usando os restos de mielina fluorescente etiquetadas e lipídios intracelulares da gota mancha.
Abstract
Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são leucócitos maduros que servem a um papel fisiológico crítico como fagócitos profissionais capazes de limpar uma variedade de partículas. Normalmente, BMDMs são restritas do sistema nervoso central (SNC), mas após uma lesão, podem facilmente se infiltrar. Uma vez dentro o tecido lesado do CNS, BMDMs são o tipo de célula primária responsável para a liberação de restos celulares derivados de lesões, incluindo grandes quantidades de detritos de mielina rica de lipídios. As ramificações neuropatológicas da fagocitose de detritos infiltração e mielina BMDM dentro o CNS são complexas e não é bem compreendido. Os protocolos descritos aqui, permitem direto em vitro estudo da BMDMs no contexto de lesão de CNS. Nós cobrimos murino BMDM isolamento e cultura, preparação de restos de mielina e ensaios para avaliar a fagocitose de restos de mielina BMDM. Estas técnicas produzem resultados quantificáveis robustos, sem a necessidade de equipamento especializado significativo ou materiais, no entanto, podem ser facilmente personalizadas para atender às necessidades dos pesquisadores.
Introduction
Macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) são um elo importante entre os sistemas imune inatos e adaptativos. Como células apresentadoras de (APCs), eles podem se comunicar com os linfócitos através de ambos apresentação de antigénios e liberação de citocinas1,2,3. No entanto, como fagócitos profissionais, sua principal função é limpar patógenos, células envelhecidas e restos celulares1,4. Na sequência de uma lesão na medula espinal (SCI), quantidades substanciais de restos de mielina é gerada a partir de oligodendrócitos moribundos, o tipo de célula responsável pela CNS axônio mielinização5. Nós e os outros têm mostrado que o afastamento dos restos de mielina é sobretudo da responsabilidade de infiltração BMDMs5,6,7. No entanto, dentro da lesão da medula espinhal com a duração de sites de restos de mielina tem sido sugerida para deslocar estas células normalmente anti-inflamatórios no sentido de um estado pro-inflamatórios5,8,9. Como principais mediadores neuro-inflamação na medula espinhal lesada, BMDMs são alvos clínicos importantes.
Para ajudar a investigar a influência da BMDMs na medula espinhal lesada, desenvolvemos um modelo in vitro para estudar diretamente como BMDMs responder aos restos de mielina. Para melhorar a relevância biológica, tanto BMDMs murino primários e os restos de mielina recentemente isoladas são usados nestas investigações. Como tal, os métodos apresentados aqui também detalham o isolamento e a cultura de BMDMs murino primários e derivado de uma técnica de gradiente de sacarose modificada usada para isolar o CNS murino mielina detritos10,11,12. Os restos de mielina podem prontamente ser rotulados com um corante fluorescente, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), para acompanhar que sua internalização por BMDMs. CFSE é bem adequada para esta aplicação, porque é não citotóxicas e suas licenças de espectro estreito fluorescente multiplexação com outras fluorescentes sondas13,14. Após a fagocitose, lipídios de restos de mielina são transportados através de lisossomos e empacotados como lipídios neutros em gotículas de lipídios intracelular5. Para quantificar este acúmulo intracelular de lipídios, apresentamos um óleo vermelho O ORO () método otimizado para análise quantitativa de imagem de coloração. Este método de coloração simples produz resultados reprodutíveis robustos e quantificação de15. Esses métodos facilitam o estudo da mielina detritos fagocitose e lipídios de retenção com equipamento especializado limitada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os procedimentos descritos aqui utilizam ambos recém isolados restos de mielina CNS bruto e macrófagos derivados da medula óssea primários. Para reduzir despesas do animais, é recomendável que os cérebros e células da medula óssea de cada rato ser colhidas no momento do sacrifício. Dois pesquisadores trabalhando juntos podem preparar ambos os materiais simultaneamente. Alternativamente, os cérebros podem ser armazenados a-80 ° C em PBS suplementadas com antibióticos antes de isolamento de restos de mielina. …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Glenn Sanger-Hodgson, especialista em mídia na faculdade de medicina de FSU, pelo seu trabalho na produção de vídeo, edição e locução.
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R01GM100474 e R01GM072611).
Materials
| DMEM | GE Healthcare Life Sciences | SH30243.01 | High glucose with L-glutamine, sodium pyruvate |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | 30-002-CI | 100X Solution |
| New Born Calf Serum (NCS) | Rocky Mountain Biologics | NBS-BBT-5XM | United States Origin |
| NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] | ATCC | CCL-1 | L929 Cell Line of Conditioned Media Preparation |
| 24-well Cell Culture Plates | VWR | 10062-896 | |
| Cell Culture Dish | Greiner Bio-One | 639960 | Polystyrine, 145/20mm |
| CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher | C34570 | DMSO for Reconsitution Provided |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-11 | |
| Oil Red O | Sigma Aldrich | O0625 | |
| Equipment | |||
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | Thinwall, Polypropylene, 38.5 mL, 25 x 89 mm |
| SW 32 Ti Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 369650 | SW 32 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium |
| Hand Held Rotary Homogenizer | Fisher Science | 08-451-71 |
Referenzen
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