G2-seq: Высокая пропускная способность на основе последовательности техника для выявления поздно репликации областей генома
Summary
Мы опишем технику для объединения проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности для определения конца репликации областей генома.
Abstract
Были разработаны многочисленные методы следить за ходом репликации ДНК через S-фазе клеточного цикла. Большинство из этих методов были направлены на выяснение местоположения и времени начала генома дублирования, вместо того, чтобы его завершения. Однако важно, что мы понимаем областей генома, которые последний для завершения репликации, потому что эти регионы страдают повышенные уровни хромосомных обрыва и мутации, и они были связаны с болезнью и старения. Здесь мы описываем, как мы расширили технику, которая была использована для мониторинга инициации репликации вместо определить те регионы генома последний для полной репликации. Этот подход основан на комбинации проточной цитометрии и высокая пропускная способность последовательности. Хотя настоящий доклад сосредоточен на применение этого метода для дрожжей, этот подход может использоваться с любой клетки, которые могут быть отсортированы в проточный цитометр согласно содержание ДНК.
Introduction
Эукариотический геном репликация инициируется в нескольких дискретных сайтов, называется происхождение репликации, от которых репликации вилки действовать в обоих направлениях (обзор в Fragkos et al., 2015-1). Истоки различаются в их сроках и эффективности стрельбы, и были разработаны несколько методы для отслеживания репликации происхождения деятельности и выяснения причин этого изменения. Деятельность отдельных происхождение может быть выведено из уровней одноцепочечной ДНК2, какие формы вокруг активной происхождение, или с помощью электрофореза геля 2D для мониторинга репликации конкретных промежуточных3, оба из которых могут быть обнаружены с радиоактивные датчики. Оба эти методы применяются более легко в S. cerevisiae чем в mammalian клетках, потому что происхождение ограничены конкретным известных последовательностей в бывшем. С появлением microarrays стало возможным оценить происхождения, выпустив глобально. Впервые это было сделано путем маркировки ДНК с тяжелых изотопов, выпуская клетки из блока G1 в средних содержащих легкие изотопы и затем мониторинг формирования тяжелых свет гибридной ДНК через генома4. Введение высокой производительности виртуализации позволило аналогичные генома широкий мониторинг активности происхождения без требования дорогих изотопный маркировки. Клетки были отсортированы в проточный цитометр согласно содержание ДНК и их подвергается глубокой секвенирования ДНК. Потому что охват последовательности продолжается от 1 x до 2 x в течение фазы S, сроки относительной репликации можно оценить путем сравнения чтения глубины клеток в S фазе для тех, кто в G1 или G25,6. Эти методы, особенно применяется для дрожжей, привело к более глубокому пониманию как последовательность ДНК, Структура хроматина и белки репликации ДНК регулировать происхождения сроках и эффективности.
Верным передачи генетической информации в ходе пролиферации требует не только успешно инициации репликации ДНК, который проходит на происхождение, но и успешного завершения репликации, которое происходит, где встречаются репликации вилки. Как начала репликации сроки завершения репликации варьируется генома с некоторых регионов, остальные нереплицированные даже поздно в клеточный цикл. Такие регионы могут быть особенно отдаленные от истоков активной репликации или могут содержать последовательностей или структур хроматина, которые препятствуют полимераз. Поздно репликации регионы могут проявить себя как хрупкие сайтов, которые связаны с хромосомной поломки и более высокие скорости мутации и были причастны к раку и старению7,8,9. Однако несмотря на важность надлежащего завершения репликации ДНК в поддержание стабильности генома, наше понимание того, где и каким образом это происходит значительно отстает в инициации репликации. И хотя отдельные гены, чьи конце репликации был связан с болезнью были изучены с, например, ПЦР10, глобальные исследования, направленные на изучение места и основные причины позднего репликации хватает. Здесь мы опишем технику, которую мы ссылаемся как «G2 seq», в котором мы комбинируем проточной цитометрии с высокой пропускной способностью последовательности пролить свет на завершении репликации генома в дрожжи11. С незначительными изменениями этот протокол может быть адаптирована к любой клетки, которые могут быть потока сортировано согласно содержание ДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя этот метод является надежной и довольно прямо вперед, особое внимание следует обратить на следующее:
(1) мы рекомендуем, что культур расти по крайней мере 12 часов прежде чем они достигнут этапа журнала, поскольку различия проявляются в клеточный цикл распределения, е?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана гранта NIH GM117446 а.б.
Materials
| YeaStar Genomic DNA kit | Genesee Scientific | 11-323 | |
| 1 µM SYTOX Green | ThermoFisher | 57020 | resuspend in 50 mM sodium citrate, pH 7.2 |
| 50 mM sodium citrate, pH 7.2 | |||
| RNase solution (0.25 mg / mL) | Sigma | R6513 | 0.25 mg / mL RNaseA resuspended in 50 mM sodium citrate, pH 7.2, boil RNase solution for 10 minutes before the first use only, and from then on store at -20° |
| proteinase K solution (20 mg / mL) | ThermoFisher / Invitrogen | 25530-015 | resuspend in 10 mM Tris, pH 7.5, 2 mM CaCl2, 50% glycerol, store at -20°C |
| Model 50 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB50A220 | |
| BD Biosciences FACSAria II | BD Biosciences | 644832 | |
| Zymo-spin III columns | Zymo Research | C1005 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher | Q32851 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | |
| Covaris Model LE220 Focused-Ultrasonicator | Covaris | 500219 | |
| Illumina TruSeq DNA LT Sample Prep Kit | Illumina | 15026486 | |
| Illumina HiSeq 2500 instrument | Illumina | SY–401–2501 | |
| gsnap alignment software | open source software / Genentech | http://research-pub.gene.com/gmap |
Referenzen
- Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. DNA replication origin activation in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).
- Santocanale, C., Diffley, J. F. A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication. Nature. 395, 615-618 (1998).
- Brewer, B. J., Fangman, W. L. A replication fork barrier at the 3′ end of yeast ribosomal RNA genes. Cell. 55, 637-643 (1988).
- Raghuraman, M. K., et al. Replication dynamics of the yeast genome. Science. 294, 115-121 (2001).
- Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity. Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).
- Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program. Genome Res. 20, 781-790 (2010).
- Lang, G. I., Murray, A. W. Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing. Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).
- Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).
- Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer. Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).
- Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. Very late DNA replication in the human cell cycle. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).
- Foss, E. J., et al. SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).
- Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality. Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).
- Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).
- Langmead, B. Aligning short sequencing reads with Bowtie. Curr Protoc Bioinformatics. , 17 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 428, 617-624 (2004).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).
