Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

1. beredning av reagens för dag 0 till dag 14 i protokollet förbereda följande medelstora komponenter: göra 100 mL av retinal differentiering medium (RDM) genom att tillsätta 1 mL 100 x N2 tillägg, 2 mL 50 x B27 tillägg och 1 mL 100 x icke-essentiell aminosyra (NEAA) till 96 mL Dulbecco ' s modified viktigt medium/näringsämne blandning F12 9 (DMEM/F12). Göra 10 mL 1 M nikotinamid (NIC) av Proteinupplösande 1.221 g av NIC 8 mL sterilt vatten, vortexa och föra volymen med 10 mL sterilt vatten. Steril filtrera lösningen. Förbereda följande tillväxtfaktorer och små molekyler: Rekonstituera rekombinant mus skalle, mänskliga dickkopf WNT signalering utbildningsavsnitt hämmare 1 (DKK-1), och IGF-1 till 100 µg/mL varje i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbuffrad lösning (PBS). Alikvot som behövs och förvaras vid-20 ° C i upp till 3 månader. Beredes FGF-basic till 10 µg/mL och rekombinant mänskliga/mus/råtta Activin A till 100 µg/mL varje i 0,1% BSA i PBS. Alikvot som behövs och förvaras vid-80 ° C upp till 1 år. Beredes SU 5402 (FGF receptor-specifika tyrosinkinashämmare) och CHIR99021 (glykogen syntetas kinase 3, GSK-3β, hämmare) 10 mm och varje dimetyl sulfoxid (DMSO). Delprov och förvaras vid-20 ° C i upp till 1 år eller 6 månader, respektive. Erhålla följande för dag 0 och dag 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic syra (EDTA) lösning (0.2 g EDTA per 1 L PBS), 1 X PBS- / – (PBS utan kalcium eller magnesium, pH 7,4), 1 x trypsin-liknande dissociation enzym (TDE), DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE stödja medium (RSM) och Y-27632 dihydroklorid (Använd vid 10 µM). 2. Dag 0: Dag av pluripotenta stamceller Passage för differentiering odla stamceller kolonier i feeder-fri, serumfritt villkor till ungefärligt 80% sammanflödet innan passaging. Obs: Se diskussion för detaljer om hur du optimerar detta steg. Coat en 12-well platta med extracellulära matrix-baserade hydrogel (ECMH) enligt tillverkarens rekommendationer. Tillåta för att ställa för 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. Alikvot volymen av RDM och PBS- / – behövs för dag 0 och varm i vattenbad till 37 ° C innan du lägger till tillväxtfaktorer. Ta EDTA rumstemperatur. Lägga till tillväxtfaktorerna som behövs för dag 0 att den värmde RDM med 10 mM NIC, 50 ng/mL skalle, 10 ng/mL DKK-1 och 10 ng/mL IGF-1. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 100 µL av NIC, 5 µl skalle, 1 µL DKK-1 och 1 µL av IGF-1 till 10 mL RDM. Plocka bort alla differentierade kolonier baserat på Morfologi från stamceller som kommer att vara passaged för differentiering. Använda en P10 Pipettera spets att manuellt ta bort de differentierade cellerna. Obs: Fibroblastic celler mellan kolonier, liksom ogenomskinlig cellerna inom kolonier tyder differentierade celler tas bort. Se diskussion för mer information om differentierade celler. Passage en enda väl 6-well platta i 4 brunnar 12-well platta (1:4). Obs: Se diskussion för detaljer om passaging stamceller i detta skede. Aspirera stamceller mediet från stamceller och Tvätta brunnarna en gång med 2 mL före värmde PBS- / -. Aspirera PBS- /- och skölj varje väl tre gånger med 1 mL av EDTA per brunn 6-well platta. Försiktigt luta plattan och aspirera på EDTA. Inte agitera plattan på något sätt att undvika att tidigt lyfta cellerna. Efter den tredje tvätten, tillsätt 1 mL av EDTA och odla i rumstemperatur i huven för 3-5 min. Stör inte plattan under denna inkubation. Sug ut EDTA och tillsätt 1 mL RDM per brunn som att dirigeras med 0,5 mL extra medium. Till exempel tvätta 1 väl av en 6-well platta med 4,5 mL av RDM plattan på 4 brunnar 12-well platta. Använda en cell-skrapa försiktigt bort cellerna. Samla alla celler i ett koniskt rör och pulverisera cellerna i RDM genom pipettering upp och ner 5 gånger. Separera stora klumpar av celler, men inte pulverisera till enda cellsuspension. Distribuera cellerna jämnt i Pipettera. Slutföra detta steg snabbt för att förhindra återfastsättning av till plattan. Utsäde cellerna på ECM-belagd 12-väl plattor (1 mL cellsuspension per brunn). Luta plattan och tillbaka för att distribuera cellerna jämnt i brunnarna. Placera försiktigt i en cell kultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2 tills nästa medium förändring. Observera den exakta tiden. Förändring mediet vid samma tid varje dag. 3. Dag 1 till 14: tillägg av tillväxtfaktorer dag 1: ändra mediet på alla brunnar (1 mL per brunn) med hjälp av RDM med tillväxtfaktor sammansättning för dag 0 (se steg 2,4). Dag 2: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 10 mM NIC, 5 ng/mL FGF-basic, 10 ng/mL skalle, 10 ng/mL DKK-1 och 10 ng/mL IGF-1. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 100 µL av NIC, 5 µL av FGF-basic, 1 µL skalle, 1 µL av DKK1 och 1 µL IGF1 10 ml av RDM. Dag 4: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1 och 10 ng/mL IGF-1. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 10 µL av activin A, 1 µL av DKK1 och 1 µL av IGF-1 till 10 mL RDM. Obs: Observera att cellerna är konfluenta i detta skede. Dag 6: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 100 ng/mL activin A och 10 µM SU 5402. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, Lägg till 10 µL av activin A och 10 µL av SU 5402 till 10 mL RDM. Dagar 8, 10 och 12: ändra mediet använder RDM (1 mL per brunn) med 100 ng/mL activin A, 10 µM SU 5402 och 3 µM CHIR99021. Från de bestånd som beskrivs i steg 1.2, tillsätt 10 µL av activin A, 10 µL SU 5402 och 3 µL av CHIR99021 10 ml av RDM. 4. Dag av berikning till passagen 0 av RPE Coat en 6-well platta med tillväxtfaktor minskas ECMH enligt tillverkarens rekommendationer. Tillåta för att ställa för 1 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C. Alikvot volymen av DPBS behövs och 1 mL RDM per brunn av anrikning och varm i vattenbad till 37 ° C. Bring TDE till rumstemperatur och varma nödvändig volym av RSM, antimikrobiell reagens och Y-27632 till 37 ° C. Lägg till antimikrobiell reagens och Y-27632 att få 0,5 x och 10 µM kompositioner respektive till RSM. Använda detta medium för de första 4-7 dagarna att förbättra fastsättning. Aspirera förbrukade medel från alla borrningar och tillsätt 1 mL per brunn av pre värmde RDM (ingen tillväxt faktorer krävs). Manuellt med dissekera Mikroskop dissekera och skrapa bort alla icke-RPE-celler som använder en P10 Pipettera spets. Obs: Se avsnittet representativa resultat för exempel. Efter dissektion, aspirera RDM och alla cell skräp. Tvätta två gånger med 1 mL före värmde DPBS per brunn. Tillsätt 0,5 mL TDE per brunn 12-well platta och inkubera vid 37 ° C i 5 min. Använd en cell skrapa försiktigt bort cellerna från plattan. Använda en P1000 Pipettera till försiktigt pulverisera cell/TDE suspensionen genom pipettering upp och ner 3 – 4 gånger till skapa en homogen suspension. Späd cell/TDE suspensionen 1:10 i förväg värmde RSM, utan Y-27632. Centrifugera cellsuspension på 173 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Aspirera på medellång från cellpelleten och resuspendera cellerna i RSM med 10 µM Y-27632 (1 mL per berikad brunn). Stam celler med en nylon mesh cell SIL med 40 µm porer. Räkna antalet celler i en angiven volym med hjälp av en hemocytometer och beräkna koncentrationen av celler i den ansträngda lösningen. Utsäde celler på tillväxtfaktorn minskas ECM-belagda plattor på 1 x 10 5 celler/cm 2 i 4 mL RSM med 10 µM Y-27632. Ersätta RSM med 10 µM Y-27632 48 h efter cell sådd och fortsätta att ersätta media var 3-4-dagar (t.ex. på måndagar och torsdagar). Ersätter inte de 10 µM Y-27632 efter 4-7 dagar. Låta cellerna att mogna i 28-35 dagar vid 37 ° C och 5% CO 2. Fortsätta att ersätta RSM var 3-4-dagar (t.ex. på måndagar och torsdagar). 5. Mognad: Passage 1 och 2 av RPE Obs: volymer är indicerat för 1 väl av en 6-well platta eller en T75 kolv som indikeras av parenteser. Mellan 28-35 dagar efter passage 0, coat en 6-well platta (T75 kolv) med ECMH enligt tillverkarens rekommendationer. Alikvot volymen av DPBS och RSM behövs och varm i vattenbad till 37 ° C. ta TDE rumstemperatur. Aspirera tillbringade varje medium från brunnarna och tvätta väl två gånger med 2 mL (10 mL) före värmde DPBS. Obs: Använd inte 10 µM Y-27632. Aspirera DPBS och tillsätt 1 mL (5 mL) TDE. Placera i inkubatorn på 37 ° C och 5% CO 2 för 5 min. Efter inkubation, Visa celler på en inverterade Mikroskop till bekräfta cellerna avtalsslutande och frikoppla. Med hjälp av en lämplig storlek cell skrapan, ta försiktigt bort cellerna från botten av brunnen eller kolv. Använda ett P1000 tips (10 mL serologiska Pipettera) att försiktigt pulverisera cell/TDE suspensionen upp och ner 3 – 4 gånger till skapa en homogen suspension. Späd cell suspension 1:10 i RSM. Reservera 2 mL (5 mL) av RSM skölj väl/kolven och Lägg till den utspädda cellsuspensionen. Obs: Låt inte enzymet exponeringstiden överstiger 25 min. Centrifugera cellsuspension på 173 x g under 5 minuter i rumstemperatur. Aspirera på medellång från cellpelleten och resuspendera cellerna i 1 mL (5 mL) av RSM Stam celler med en nylon mesh cell SIL med 40 µm porer. Räkna antalet celler i en angiven volym med hjälp av en hemocytometer och beräkna koncentrationen av celler i den ansträngda lösningen. Utsäde celler på ECMH-belagda plattor på 1 x 10 5 celler/cm 2 4 ml (15 mL) av RSM. Låta cellerna att mogna i 30 dagar. Fortsätta att ändra RSM varje 3-4 dagar. Upprepa ovanstående procedur (steg 5.2-5.11) vid dag 30 till passage cellerna från passage 1 till 2. 6. Skapa en mellanliggande Cell Bank: Frysförvaring av Passage 2 dag 3-5 RPE Obs: frysa celler medan de är subconfluent (~ 50%) och har inte återfått pigment. Baserat på antalet celler, beräkna volymen av frysförvaring medium med 10% DMSO behövs för att resuspendera cellerna vid en koncentration på 3 x 10 6 celler/mL. Följ steg 5.2 till 5,8. Omsuspendera cellpelleten frysförvaring medium med 10% DMSO till 3 x 10 6 celler/mL och överför 1 mL cellsuspension till 1,2 mL injektionsflaskor av kryogen. Placera kryogen injektionsflaskor i en frysning behållare avsedd att kyla vid-1 ° C/min och placera vid-80 ° C över natten. Överföra till flytande kväve för långsiktig lagring. Obs: Dessa celler kommer att passagen 3 vid upptining. Odla cellerna för 30 dagar innan karakterisering. Utsäde passage 3 RPE 1,5 x 10 5 per cm 2 vid upptining. 2 , 4 , 6 , 7