JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Entwicklungsbiologie

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Published: October 30, 2017
doi:
10.3791/56274
,
1Center for Stem Cell Biology and Engineering,University of California, Santa Barbara

Summary

Этот протокол описывает, как производить эпителиальных клеток пигмента сетчатки (ПЭС) от плюрипотентных стволовых клеток. Данный метод использует сочетание факторов роста и малых молекул направлять дифференцирования стволовых клеток в незрелых НПП в четырнадцать дней и зрелые, функциональный НПП после трех месяцев.

Abstract

Мы описываем надежный метод прямого дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в сетчатке глаза пигментные клетки эпителия (ПЭС). С целью предоставления подробного и тщательного протокол является четко продемонстрировать каждый шаг и сделать это легко доступны для исследователей в области. Этот протокол приводит однородный слой ПЭС с минимальными или нет ручной рассечение необходимо. Метод, представленный здесь было показано, быть эффективным для индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ВРКП) и человеческих эмбриональных стволовых клеток. Кроме того мы описываем методы криоконсервирования банков промежуточных клеток, которые позволяют длительного хранения. НПП, созданные с помощью этого протокола может оказаться полезным для iPSC болезни в блюдо моделирования или клинического применения.

Introduction

Пигментный эпителий сетчатки это монослой пигментные клетки, который обеспечивает важную поддержку фоторецепторов. Эпителиальные клетки пигмента сетчатки (ПЭС) имеют многочисленные функции в видение, в том числе поглощения света, питательных веществ и ионный транспорт, ретиноидов Велоспорт, фоторецепторных наружный сегмент фагоцитоза, и секрецию1фактора роста. Существует целый ряд дистрофий сетчатки, которые влияют на функцию НПП и привести к потере зрения, включая age-related macular вырождения и пигментный ретинит. Поколение НПП от плюрипотентных стволовых клеток может облегчить исследование, чтобы понять эти глазных заболеваний и может предоставить неограниченный источник НПП для клетки терапии2. В самом деле несколько клинических испытаний продолжается используют ПЭС, производные от плюрипотентных стволовых клеток3.

Этот протокол дифференциации первоначально был описан Бухгольц4 и было основано на методе ранее опубликованные Клегг5. Процедура имитирует процесс развития нормальной в естественных условиях прямого недифференцированные плюрипотентных стволовых клеток к НПП судьба через манипуляции инсулина факторов роста (IGF), основные фибробластический фактор роста (FGF-2; FGF-basic), превращая фактор роста бета (TGF-β) и WNT пути4,5. Протокол была значительно улучшена путем добавления агонист путь WNT поздно в протоколе, который принесли 97.77% ± 0,1% pre Меланосома белка (PMEL) клеток и была адаптирована к xeno свободных условий6,7. Было показано, что результирующая НПП выразить НПП маркеры на уровне Стенограмма и белка, чтобы выделяют известных факторов роста ПЭС с соответствующей полярности и осуществляют фагоцитоз наружной сегментов фоторецепторных8. Этот протокол является более быстрым и надежным, чем «спонтанное» протоколы дифференциации, которые включают простое удаление основных фибробластический фактор роста8. Кроме того РНК последовательности, которую данные показывают, что НПП полученные с помощью этого протокола очень похожи на тех, полученные с помощью более общих спонтанное подход8. 14-дневный метод создает ПЭС, которые соответствуют «5 P» упомянута Маццони9 (пигментные, поляризованные, фагоцитарной, пост митотическая, полигональные)9. Хотя эта процедура оказалась воспроизводимые в нескольких лабораториях, мы хотели бы отметить ряд дополнительных направленного дифференцирования методы, которые были опубликованы в последние годы10,11,12 , 13.

Protocol

1. Подготовка реагентов для день 0 день 14 Протокола подготовить следующие компоненты среднего: сделать 100 мл сетчатки дифференциации среднего (RDM), добавив 1 мл 100 x N2 дополнение, 2 мл 50 x B27 дополнения и 1 мл 100 x несущественные аминокислот (NEAA) 96 мл Дульбекко ' s изменены основные средне/питательной смеси 9 F12 (DMEM/F12). Сделать 10 мл 1 М никотинамид (NIC) путем растворения 1.221 g NIC в 8 мл стерильной воды, vortexing и чего объем до 10 мл стерильной водой. Стерильными фильтр решение. Подготовить следующие факторы роста и малых молекул: воссоздать рекомбинантных мыши льют, АБС битор путь WNT сигнализации человека dickkopf 1 (DKK-1) и IGF-1 до 100 мкг/мл каждый в 0,1% альбумина bovine сыворотки (BSA) в растворе фосфат амортизированное (PBS). Алиготе, при необходимости и хранить при температуре-20 ° C до 3 месяцев. Восстановить ФБП основные 10 мкг/мл и рекомбинантного человека/мыши/крыса Activin A до 100 мкг/мл каждый в 0,1% BSA в PBS. Алиготе, при необходимости и хранить при температуре-80 ° C на срок до 1 года. Воссоздания Су 5402 (ФБП специфических рецепторов тирозин киназы ингибитора) и CHIR99021 (гликоген синтазы киназа 3, ГСК 3β, ингибитор) до 10 мм в диметилсульфоксида (ДМСО). Алиготе и хранить при-20 ° C до 1 год или 6 месяцев, соответственно. Получить следующий день 0 и/или день 14: 1-x ethylenediaminetetraacetic кислоты (ЭДТА) раствор (0,2 г на 1 Л PBS ЭДТА), ПБС- / – (PBS без кальция или магния, рН 7,4), 1 x трипсина как диссоциации фермента (TDE), DPBS (Дульбекко ' s PBS), НПП, поддержка среднего (RSM) и Y-27632 дигидрохлорид (использование на 10 мкм). 2. : 0 день плюрипотентных стволовых клеток прохода для дифференциации расти стволовых клеток колоний в фидера, сыворотка бесплатно условиях до примерно 80% слияния перед пассированый. Примечание: Смотрите обсуждение подробную информацию на этот шаг оптимизации. Слой 12-ну плита с внеклеточная матрица на основе гидрогеля (ECMH) в соответствии с рекомендациями производителя. Позволяют задать за 1 ч, при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. Алиготе объем RDM и PBS- / -, необходимые для день 0 и тепло в водяной бане до 37 ° C перед добавлением факторов роста. Довести до комнатной температуры ЭДТА. Добавить факторы роста, необходимых для день 0 утепленные RDM с 10 мм NIC, льют 50 нг/мл, 10 нг/мл DKK-1 и 10 нг/мл ИФР-1. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 100 мкл NIC, 5 мкл льют, 1 мкл DKK-1 и 1 мкл IGF-1 до 10 мл RDM. Выбрать для удаления всех дифференцированной колоний, основанный на словотолковании из стволовых клеток, которые будут пассированной для дифференциации. Использовать наконечник пипетки P10, чтобы вручную удалить дифференцированных клеток. Примечание: Фибробластический клетки между колониями, а также непрозрачные клетки внутри колонии указывают дифференцированных клеток должны быть удалены. Смотрите обсуждение сведения о дифференцированных клеток. Проход одного хорошо 6-ну плиты в 4 скважины 12-ну тарелку (1:4). Примечание: Смотрите обсуждение для деталей на пассированый стволовых клеток на данном этапе. Аспирационная средних стволовых клеток из стволовых клеток и Промыть лунки с 2 мл подогретым PBS- / -. Аспирационная PBS- / – и промыть хорошо три раза с 1 мл ЭДТА на хорошо пластины 6-а. Нежно наклона пластины и аспирационная ЭДТА. Не агитировать пластины в любой способ избежать преждевременного снятия клетки. После третьей стирки, добавляют 1 мл ЭДТА и инкубации при комнатной температуре в капот для 3-5 мин. Не беспокоить плиты во время этой инкубации. Аспирационная ЭДТА и добавить 1 мл RDM на хорошо, что будет заполнена с 0,5 мл дополнительной среды. Например, вымыть 1 хорошо 6-ну пластины с 4,5 мл RDM пластины на 4 скважины плиты 12-а. Использовать скребок ячейки для аккуратно отсоединить клетки. Собрать все клетки в коническую пробирку и нарезанных клетки в RDM, закупорить вверх и вниз 5 раз. Отделить большого скопления клеток, но не нарезанных на одну ячейку подвеска. Распространите ячейки равномерно в пипетки. Завершить этот шаг быстро, чтобы предотвратить приложения к пластине. Семя клетки на ECM-покрытием 12-ну тарелки (1 мл суспензии клеток в колодец). Наклона пластины взад и вперед, чтобы распределить клетки равномерно на протяжении скважины. Осторожно поместите в инкубатор культуры клеток при 37 ° C и 5% CO 2 до следующего изменения средних. Обратите внимание на точное время. Изменения среды в то же время каждый день. 3. День 1 – 14: дополнение факторы роста 1 день: изменить среду на всех скважинах (1 мл на хорошо) использование RDM с состав фактор роста для день 0 (см. шаг 2.4). День 2: изменить носитель, с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 10 мм NIC, 5 нг/мл ФБП основные, льют 10 нг/мл, 10 нг/мл DKK-1 и 10 нг/мл ИФР-1. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 100 мкл NIC, 5 мкл ФБП-Basic, 1 мкл льют, 1 мкл DKK1 и 1 мкл IGF1 до 10 мл RDM. День 4: изменить носитель с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 100 нг/мл activin A, 10 нг/мл DKK-1 и ИФР-1 10 нг/мл. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 10 мкл activin A, 1 мкл DKK1 и 1 мкл IGF-1 до 10 мл RDM. Примечание: Наблюдать, что на данном этапе клетки вырожденная. День 6: изменить носитель с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 100 нг/мл activin и 10 мкм Су 5402. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 10 мкл activin A и 10 мкл Су 5402 до 10 мл RDM. Дней, 8, 10 и 12: изменить носитель с помощью RDM (1 мл на хорошо) с 100 A activin нг/мл, 10 мкм Су 5402 и 3 мкм CHIR99021. Из запасов, описанный в шаге 1.2, добавить 10 мкл activin A, 10 мкл SU 5402 и 3 мкл CHIR99021 10 мл RDM. 4. День обогащения для прохода 0 НПП пальто 6-ну плита с фактором роста сократить ECMH в соответствии с рекомендациями производителя. Позволяют задать за 1 ч, при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C. Алиготе объем необходимых DPBS и 1 мл RDM на хорошо обогащения и тепло в водяной бане до 37 ° C. Bring TDE в комнатной температуре и теплые необходимый объем RSM, противомикробные реагента и Y-27632 до 37 ° C. Добавить антимикробной реагента и Y-27632 получения 0.5 x и 10 композиций мкм соответственно к RSM. Использовать это средство для первых 4-7 дней для улучшения вложение. Провел среднего аспирата из всех скважин и добавить 1 мл на хорошо подогретым RDM (факторы роста не требуется). Вручную с использованием рассечения микроскопа, вскрыть и отчищать все клетки не ПЭС с помощью кончика пипетки P10. Примечание: В разделе представитель результаты примерами. После вскрытия, аспирационная RDM и все ячейки мусор. Мыть дважды с 1 мл раствора подогретым DPBS за хорошо. Добавить 0,5 мл TDE на колодец 12-ну плиты и инкубировать при 37 ° C за 5 минут использования скребка клетки аккуратно удалить ячейки из пластины. Используйте P1000 пипетки для нежно нарезанных подвеска клеток/TDE, закупорить вверх и вниз 3 – 4 раза для создания единообразного подвеска. Развести клеток/TDE подвеска 1:10 в подогретым RSM, без Y-27632. Центрифуга суспензию клеток в 173 x g 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная среднего из клеток гранул и Ресуспензируйте клетки в RSM с 10 мкм Y-27632 (1 мл на обогащенный колодец). Деформации клетки, с использованием клеток сетчатый нейлон с 40 мкм поры. Подсчитать количество ячеек в указанном объеме с помощью Горяева и рассчитать концентрацию клеток в решении напряженных. Клетки семян на фактор роста сокращены ECM-покрытием пластин на 1 х 10 5 клеток/см 2 в 4 мл RSM с 10 мкм Y-27632. Заменить RSM 10 мкм Y-27632 48 ч после заполнения ячейки и продолжать заменить СМИ каждые 3-4 дней (например по понедельникам и четвергам). Не заменять 10 мкм Y-27632 после 4-7 дней. Позволяют клеткам Зрелые 28-35 дней при 37 ° C и 5% CO 2. Продолжать заменить RSM каждые 3-4 дней (например по понедельникам и четвергам). 5. Созревания: Проход 1 и 2 НПП Примечание: тома указаны за 1 хорошо 6-ну плиту или T75 колбу, как указано в скобках. Между дней 28-35 прохода 0, 6-ну плита (фляга T75) с ECMH в соответствии с рекомендациями производителя пальто. Алиготе объем DPBS и RSM необходимой и тепло в водяной бане до 37 ° C. TDE довести до комнатной температуры. Аспирата провел среднего из скважин и мыть хорошо дважды с 2 мл (10 мл) подогретым DPBS. Примечание: Не используйте 10 мкм Y-27632. Аспирационная DPBS и добавить 1 мл (5 мл) TDE. Место в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO 2 на 5 мин. После инкубации, вид клетки на инвертированным микроскопом для подтверждения клетки Договаривающихся и отсоединение. Скребком соответствующего размера ячейки, аккуратно удалить ячейки из нижней части хорошо или фляги. Использовать кончик P1000 (10 мл Серологические Пипетки) для нежно нарезанных клеток/TDE подвески вверх и вниз 3 – 4 раза для создания единообразного подвеска. Развести клеток подвеска 1:10 в RSM. Резерв 2 мл (5 мл) RSM промыть хорошо/колба и добавить в суспензию клеток разреженных. Примечание: Не позволяют фермента Выдержка превышает 25 мин Центрифуга суспензию клеток в 173 x g 5 мин при комнатной температуре. Аспирационная среднего из клеток гранул и Ресуспензируйте клеток в 1 мл (5 мл) RSM Деформации клетки, с использованием клеток сетчатый нейлон с 40 мкм поры. Подсчитать количество ячеек в указанном объеме с помощью Горяева и рассчитать концентрацию клеток в решении напряженных. Семя клетки на пластины с покрытием ECMH на 1 х 10 5 клеток/см 2 в 4 мл (15 мл) RSM. Позволяют клеткам Зрелые за 30 дней. Продолжать менять каждые 3-4 дня RSM. Повторите вышеописанную процедуру (шаг 5.2-5.11) в день 30 для прохода клетки от прохода 1-2. 6. Создание промежуточного Банк клеток: криоконсервирования проход 2 день 3-5 НПП Примечание: криоконсервации клеток, хотя они subconfluent (~ 50%) и не восстановили пигмента. На основе числа клеток, рассчитать объем криоконсервирования среды с 10% ДМСО, необходимых для Ресуспензируйте клетки в концентрации 3 х 10 6 клеток/мл. Выполните шаги 5.2 до 5,8. Ресуспензируйте Пелле клеток в среде криоконсервирования с 10% ДМСО 3 х 10 6 клеток/мл и 1 мл суспензии клеток передавать криогенных 1,2 мл флаконах. Место криогенных флаконов в контейнере замораживания, предназначенные для охлаждения-1 ° C/мин и место-80 ° c на ночь. Передачи для жидкого азота для долгосрочного хранения. Примечание: Эти клетки будет проход 3 после оттаивания. Культура клетки за 30 дней до характеристик. Семя проход 3 НПП 1,5 x 10 5 на 2 см после оттаивания. 2 , 4 , 6 , 7

Representative Results

Этот метод приводит в производстве однородной, пигментированный и кубическим монослоя ПЭС. График на рисунке 1 соответствует образы, изображенные на рисунке 2. Как показано на рисунке 2А, стволовых клеток колонии плотно упакованы с определенными краями и не фибробластический клетки между колониями или непрозрачным клетки в колониях. Рисунок 2B обеспечивает представление незрелых ПЭС, subconfluent. Если клетки уже вырожденная на данном этапе, они не могут расширить прогнозы, которые имеют решающее значение для процесса дифференцировки. Клетки, которые сильно subconfluent не сможет создать монослоя и формируют плотные соединения, характерные эпителия. Подробная информация о том, как оптимизировать этот слияния изложены в разделе обсуждения. Рисунок 2 c показана морфология два наиболее распространенных видов НПП, которые могут возникнуть в ходе этого процесса дифференцировки: нейронные или фибробластический патчи. Важно отметить, что эти нейронные пятна появляются особенно непрозрачной на рассечения микроскопа, тогда как определено, фибробластический как пятна почти полупрозрачные на рассечения микроскопа. Это может быть полезно пометить эти районы на культуре ткани тарелку с ручкой этанола доказательство лаборатории более легко идентифицировать их как составные световой микроскоп, так и для рассечения Микроскоп. 2D-F цифры показывают характерным ярко границ, булыжник морфологии и пигментации, свидетельствуют о здоровых, созревания культуры НПП. На рисунке 3 приведена выше увеличение изображение, чтобы показать различные внешний вид полностью зрелые ПЭС, изображены Фазовый контраст и яркие области микроскопии. При прохождении 3 день 30, клетки готовы для характеризации, которое было описано в предыдущих публикациях, включая выражение РНК, белков, секрецию фактора роста и фагоцитоз2,4,6 ,7. Эти характеристики показывают, что клетки, представленных в эти образы не только пигментные и кубическим, но также фагоцитарной, пост митотическая и поляризованные. Рисунок 1:. Временная шкала для добавления факторов роста и созревания ПЭС. Факторы роста добавляются к 12-ну пластины от 0-14 день. Созревания НПП культивируемых в 6-ну пластин или T75 колбы от дня обогащения до 30 дней после оттепели (проход 3 день 30). Стрелки показывают, пассированый ферментативные клеток. (A-E) ниже сроки соответствуют изображения на рисунке 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: представитель морфологии и слияния созревания ПЭС. Индуцированных плюрипотентных стволовых клеток непосредственно перед пассированый для дифференциации (A). Незрелые клетки subconfluent НПП в день 2 (B) и выбрать Удалить обогащения на день 14; патчи не ПЭС (обозначается белыми стрелками) отображаются в виде патчей или непрозрачный «ленты» (C). НПП в проход, 0, 1 и 3 на день 30 (D, E и F). Шкалы бар = 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: Зрелые НПП при прохождении 3: день 30 Шестигранника морфологии, изображенные в Фазовый контраст (A) и пигментации, изображенные в ярко поля (B). Шкалы бар = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол описывает, как производить клетки сетчатки пигментного эпителия от плюрипотентных стволовых клеток. Метод был оптимизирован с помощью обоих человеческого эмбриона и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из метода фидер бесплатно, сыворотка культуры. С момента первоначального изоляции человеческих эмбриональных стволовых клеток в 1998 году и дифференцирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) в 2007 году множество культуры стволовых клеток, которые методы были разработаны,14,,1516 17. Эти методы должны быть достаточно для производства стволовых клеток колонии, которые подвержены такой дифференциации. Есть никаких известных ограничений применимости этого метода, чтобы правильно производных и поддерживается плюрипотентных стволовых клеток.

Наиболее важные шаги, пассированый стволовых клеток в день 0 дифференциации (шаг 2.5) и потенциальную потребность в ручной рассечение на 14 день процесса (шаг 4.5). При выборе удалить дифференцированных клеток из стволовых клеток колоний, обратитесь к изображениям в Кент18. Как указано, фибробластический клетки между колониями и непрозрачные клетки внутри колонии указывают дифференцированных клеток, которые должны быть удалены перед началом этот протокол18. Для дифференциации следует пассированной только недифференцированный, плотно упакованные колоний с определенными краями.

Количество стволовых клеток, семенами в колодец (шаг 2.6.7) осложняется тем, что стволовые клетки не могут быть triturated в одну ячейку подвеска после прохода и не может считаться точно с помощью Горяева. Приближение 80% вырожденная стволовых клеток указывается пассированый 1 хорошо 6-ну плиты в 4 скважины 12-ну плиты. Различия между линий стволовых клеток, таких, как темпы роста, может повлиять на как быстро незрелых НПП достичь слияния между 0 до 4 дней. Стволовые клетки будут производить НПП независимо от точного слияния, но ячейка урожай будет отрицательно сказываться если клетки слишком скудны на этой стадии. Незрелые клетки НПП должно быть примерно 40-50% притока на 1 день и почти 100% притока на 4 день. Если клетки не приносят вырожденная монослоя день 4 или 6, протокол должен повторяться на более высокую плотность посева в день 0. Например если 1 хорошо пластины 6-ну был пассированной для 4 скважин 12-ну плиты в день 0 и незрелых НПП не 100% притока на 4 день, уменьшить посева до 1:3 или 1:2 прохода на день 0 или позволить стволовые клетки стать более вырожденная перед пассированый. Очень важно создать последовательную плотность посева при сравнении нескольких клеточных линий.

Ручной рассечение шаг на 14 день необходим только в случае, когда не ПЭС клетки присутствуют в культуре (рис. 2 c). С добавлением CHIR99021 к протоколу многие линии плюрипотентных стволовых клеток требуют практически нет ручной рассечение. Некоторые препараты имеют более высокий уровень нейронных патчи, и важно, чтобы удалить эти клетки. Если НПП не являются жизнеспособными в проход 0 через проход 3, можно повторить дифференциация протокол принимая достаточное время, чтобы удалить все клетки не ПЭС. Это случается не часто, но она упоминается здесь отметить, что шаг рассечение на 14 день могут быть оптимизированы при необходимости.

Существует множество НПП дифференциация протоколов, которые различаются по стоимости, а также культура методы, эффективность, количественной оценки, и функциональной оценки, последний из которых был тщательно рассмотрены2. Мы предпочитаем метод 14-дневный подробную здесь из-за его эффективность, приспособляемость и применимости к широкому спектру клеток линии4,,78. Криоконсервация шаг в этот протокол также обеспечивает одним из основных преимуществ в создании промежуточных ячейки банка для использования в будущем, избегая лот для лота изменчивости в экспериментах. Начиная с только 4 скважины плиты 12-Ну, это возможность расширить в 6-ну пластины на проход 0 и T75 колбы на проход 1 и 2. На проход 3-5 2 день когда клетки все еще subconfluent и не восстановили пигмент, возможна криоконсервировать десятки миллионов клеток и затем разморозить Зрелые ПЭС, Места для прохода 3 день 30, чтобы проверить выражение РНК, белков, фактор роста секреция, фагоцитоз, и т.д. Мы также разработали протоколы для расширения НПП до 13 проходы 19.

Заглядывая вперед, этот метод будет полезным для iPSC моделирования глазные болезни и для поколения НПП для клеточной терапии. Что касается iPSC болезни моделирования, этот протокол в настоящее время используется в лаборатории для производства НПП от ТРИФОСФАТЫ исправлены линий с-исправлены контроля из той же пациентки. Кроме того этот протокол является адаптируемой синтетических субстратов и xeno свободных условий, которые являются полезными для соблюдения надлежащей производственной практики, необходимых для клеточной терапии.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана инициатива гирлянда для видения, Калифорнийский институт для регенеративной медицины (CIRM; грантов DR1-01444, CL1-00521, TB1-01177, FA1-00616 и TG2 01151), Вермонт общественный фонд, Фонд Breaux и Фонд, борьба слепота Винн Gund трансляционного исследования ускорение программы.

Materials

SterilGARD III laminar flow biosafety cabinet Baker model: SG603A-HE, type: A2, class: 2 6' Baker laminar flow biosafety cabinet
Dissection Hood Labconco Model 3970405 laminar flow bench top
dissecting microscope Nikon SMZ 1500 heated stage
air-jacketed CO2 incubator Sanyo MCO-17AIC 37 oC and 5% CO2
inverted phase contrast microscope Olympus IX53
Name Company Catalog Number Comments
Media Components
DMEM/F12 Gibco 10565042
N2 Supplement Gibco 17502048
B27 Supplement Gibco 17504044
NEAA Gibco 11140050
Name Company Catalog Number Comments
Growth Factors and Reagents
Nicotinamide Sigma N0636
Recombinant mouse noggin R&D systems 1967-NG-025
Recombinant human DKK-1 R&D systems 5439-DK-010
Recombinant IGF-1 R&D systems 291-G1-200
FGF-basic Peprotech 100-18B
Recombinant human/mouse/rat Activin A Peprotech 120-14E
SU5402 FGF inhibitor Santa Cruz Biotechnology sc-204308
Name Company Catalog Number Comments
Substrates
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, LDEV-Free Corning 356237 extracellular matrix-based hydrogel (ECMH)
Matrigel hESC-Qualified Matrix, LDEV-Free Corning 354277 growth factor reduced ECMH
Name Company Catalog Number Comments
Other reagents
1X Versene (EDTA) Gibco 15040066
DPBS Gibco 14190250
1X PBS (no calcium, no magnesium) Gibco 10010023
TrypLE (trypsin-like dissociation enzyme, TDE) Gibco 12563011
X-VIVO 10 (RPE supporting medium) Lonza BW04-743Q
Y-27632 Tocris 12-541-0 (1254)
CryoStor CS10 BioLife Solutions 210102 cryopreservation medium
1.2 mL Cryogenic Vial Corning 430487
Mr. Frosty (freezing container) Nalgene 5100-0001 freezing container
Normocin Invivogen ant-nr-2 antimicrobial reagent
Name Company Catalog Number Comments
Other Equipment
Pipet-aid Drummond 4-000-101
12-well culture plate Corning CLS3516 Used during differentiation.
T75 flask Corning 430641 Used during RPE maturation.
6-well culture plate Corning CLS3513 Used during RPE maturation.
cell scraper Corning 08-771-1A Used during passages.
cell strainer Falcon 352340 Used during passages before cell count.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol. Rev. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Leach, L. L., Clegg, D. O. Concise Review: Making Stem Cells Retinal: Methods for Deriving Retinal Pigment Epithelium and Implications for Patients With Ocular Disease. Stem Cells. 33 (8), 2363-2373 (2015).
  3. Pennington, B. O., Clegg, D. O. Pluripotent Stem Cell-Based Therapies in Combination with Substrate for the Treatment of Age-Related Macular Degeneration. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 261-271 (2016).
  4. Buchholz, D. E., Pennington, B. O., Croze, R. H., Hinman, C. R., Coffey, P. J., Clegg, D. O. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Transl. Med. 2 (5), 384-393 (2013).
  5. Clegg, D. O., Buchholz, D., Hikita, S., Rowland, T., Hu, Q., Johnson, L. V. Retinal Pigment Epithelial Cells: Development In Vivo and Derivation from Human Embryonic Stem Cells In Vitro for Treatment of Age-Related Macular Degeneration. Stem Cell Res. Ther. (Chapter 1), 1-24 (2008).
  6. Leach, L. L., Buchholz, D. E., Nadar, V. P., Lowenstein, S. E., Clegg, D. O. Canonical/β-catenin Wnt pathway activation improves retinal pigmented epithelium derivation from human embryonic stem cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56 (2), 1002-1013 (2015).
  7. Pennington, B. O., Clegg, D. O., Melkoumian, Z. K., Hikita, S. T. Defined culture of human embryonic stem cells and xeno-free derivation of retinal pigmented epithelial cells on a novel, synthetic substrate. Stem Cells Transl. Med. 4 (2), 165-177 (2015).
  8. Leach, L. L., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium: A Comparative Study Between Cell Lines and Differentiation Methods. J. Ocul. Pharmacol. Ther. 32 (5), 317-330 (2016).
  9. Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture. Exp. Eye Res. 126, 51-60 (2014).
  10. Sonoda, S., Spee, C., Barron, E., Ryan, S. J., Kannan, R., Hinton, D. R. A protocol for the culture and differentiation of highly polarized human retinal pigment epithelial cells. Nat. Protoc. 4 (5), 662-673 (2009).
  11. Choudhary, P., et al. Directing Differentiation of Pluripotent Stem Cells Toward Retinal Pigment Epithelium Lineage. Stem Cells Transl. Med. 6 (2), 490-501 (2017).
  12. Maruotti, J., et al. Small-molecule-directed, efficient generation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (35), 10950-10955 (2015).
  13. Lane, A., et al. Engineering efficient retinal pigment epithelium differentiation from human pluripotent stem cells. Stem Cells Transl. Med. 3 (11), 1295-1304 (2014).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  16. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  17. Amit, M., Itskovitz-Eldor, J. Derivation and spontaneous differentiation of human embryonic stem cells. J. Anat. 200 (Pt 3), 225-232 (2002).
  18. Kent, L. Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (34), e1427-e1427 (2009).
  19. Croze, R. H., et al. ROCK Inhibition Extends Passage of Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Pigmented Epithelium. Stem Cells Transl. Med. 3 (9), 1066-1078 (2014).

Tags

Retinal Pigment Epithelial CellsHuman Embryonic Stem CellsInduced Pluripotent Stem CellsRetinal DifferentiationDirected DifferentiationStem Cell BiologyEye ResearchRPERetinal DevelopmentStem Cell Disease ModelGrowth FactorsSmall MoleculesExtracellular MatrixHydrogelEDTACell PassagingCell RemovalUndifferentiated Stem CellsEfficiencyEnrichment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (128), e56274, doi:10.3791/56274 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image