인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

1. 프로토콜의 하루 14 일 0 시 약 준비 다음 중간 구성 요소 준비: 100 x N2 보충의 2 개 mL의 1 mL을 추가 하 여 망막 차별화의 만들 100 mL 매체 (RDM) 50 x B27 보충, 및 비 본질적인 아미노산 (NEAA) Dulbecco의 96 mL에 x 100의 1 mL ' s 수정 필수 매체/영양소 혼합 F12 9 (DMEM/F12). 게 10 mL의 멸 균 물, vortexing, 볼륨 살 균 물 10 mL에 8 mL에 NIC의 녹이는 1.221 g 1 M 니코틴 (NIC)의. 멸 균 필터 솔루션. 다음 성장 요인 및 작은 분자 준비: Reconstitute 재조합 마우스 머리, 인간 dickkopf WNT 신호 통로 억제제 1 (DKK-1), 100 µ g/ml 각 0.1% 소 혈 청 알 부 민에 IGF-1 (BSA) 인산 염 버퍼 솔루션 (PBS). 필요에 따라 약 수와 최대 3 개월 동안-20 ° C에서 저장소. 다시 10 µ g/mL 및 재조합 형 인간/마우스/쥐 Activin A를 100 µ g/mL 각 PBS에 0.1 %BSA FGF-기본 구성. 필요에 따라 약 수와 최대 1 년-80 ° C에서 저장소. Reconstitute 수 5402 (FGF 수용 체 특정 티로신 키 니 아 제 억제 물) 및 CHIR99021 (글 리 코겐 synthase 키 3, GSK-3β, 억제제) 10 m m 각 디 메 틸 sulfoxide (DMSO). 약 수와 최대 1 년 또는 6 개월,-20 ° C에 게 각각. 하루 0 / 하루 14: 1 x ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션 (EDTA PBS의 1 L 당 0.2 g), 1 X PBS-/-다음을 얻기 없이 칼슘 또는 마그네슘, pH 7.4 (PBS), 1 x 트립 신 같은 분리 효소 (TDE) DPBS (Dulbecco ' s PBS), RPE 지원 매체 (RSM), 및 Y-27632 dihydrochloride (10 µ M에서 사용). 2. : 0 하루 차별화 Pluripotent 줄기 세포 통로의 뿌리고 전에 약 80% 합류 급지대, 혈 청 없는 조건에서 성장 줄기 세포 식민지. 참고:이 단계를 최적화에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오. 코트 12 잘 플레이트 세포 외 매트릭스 기반 하이드로 겔 (ECMH) 제조 업체의 권장 사항에 따라와. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c. RDM와 PBS-/-성장 요소를 추가 하기 전에 하루에 0 하 고 37 ° C에 물 욕조에 따뜻한 필요한 양의 약 수. 실내 온도에 EDTA를 가져올. 는 10mm NIC, 50 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1으로 따뜻하게 RDM 0 하루에 필요한 성장 인자를 추가합니다. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC의 100 µ L, 머리의 5 µ l, 1 µ L DKK-1, 그리고 IGF-1의 1 µ L RDM의 10 mL. 모든 차별화 된 식민지에서 차별 화를 위한 passaged 줄기 세포 형태에 따라 제거를 선택 합니다. P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 수동으로 제거 하는 차별화 된 셀. 참고: 식민지 내의 불투명 셀 뿐만 아니라 식민지 사이 Fibroblastic 셀 제거할 차별화 된 셀을 나타냅니다. 차별화 된 셀에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오. 12-잘 접시 (1:4)의 4 우물으로 6 잘 플레이트의 단일 잘 통과. 참고:이 단계에서 줄기 세포를 뿌리고에 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오. 줄기 세포에서 줄기 세포 중간 발음 하 고 씻어 미리 데워 공영-/-의 2 개 mL를 한번 우물. 발음 PBS-/-와 린스 각 세 번 잘 6 잘 플레이트의 당 EDTA의 1 mL. 부드럽게 접시를 기울기 고 EDTA를 발음. 중간 셀 리프팅 피하기 위해 어떤 식으로든에서 접시를 선동 하지 마십시오. 3 세척 후 EDTA의 1 mL을 추가 하 고 3-5 분에 대 한 후드에 실 온에서 품 어. 이 잠복기 동안 접시를 방해 하지 마십시오. 는 EDTA를 발음 하 고 여분의 매체의 0.5 mL와 함께 시드 것입니다 잘 당 RDM의 1 mL를 추가 합니다. 예를 들어 12-잘 접시의 4 우물에 접시를 RDM의 4.5 mL 6 잘 플레이트의 1 세척. 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 부드럽게 세포를 분리. 원뿔 튜브에 있는 모든 셀을 수집 하 고 5 번 위아래로 pipetting으로 RDM 셀 triturate. 셀의 큰 덩어리를 분리 하지만 단일 세포 현 탁 액을 triturate 하지 마십시오. 셀에 피펫으로에 균등 하 게 배포 합니다. 접시에 뚝을 방지 하기 위해 신속 하 게이 단계를 완료. ECM 코팅 12-잘 접시 (잘 당 세포 현 탁 액 1 mL)에 셀 씨. 우물에 걸쳐 균등 하 게 셀을 앞뒤로 접시 기울기. 부드럽게 장소에서 37 ° C, 5% CO 2 셀 문화 인큐베이터에서 다음 중간 변경까지. 참고 정확한 시간. 매일 같은 시간에 변경 중간. 3. 하루 1 ~ 14: 추가의 성장 요인 1 일: 모든 우물 (우물 당 1 mL)에 매체 변경 RDM을 사용 하 여 0 (단계 2.4 참조)에 대 한 성장 인자 성분과. 주 2: 10 mm NIC RDM (우물 당 1 mL), 5 ng/mL FGF-기본, 10 ng/mL 머리, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가 NIC, FGF-기본 5 µ L, 머리의 1 µ L, DKK1의 1 µ L 및 i g f 1의 1 µ L의 100 µ L RDM의 10 mL. 주 4: 100 ng/mL activin A, 10 ng/mL DKK-1, 그리고 10 ng/mL IGF-1 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, DKK1의 1 µ L 및 IGF-1의 1 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL. 참고:이 단계에서 세포는 confluent 관찰. 주 6: 5402 100 ng/mL activin A와 10 µ M 수 RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 activin A의 10 µ L 및 10 µ L의 수 5402 ~ 10 mL RDM 추가. 일 8, 10, 12: 3 µ M와 100 ng/mL activin A, 10 µ M 수 5402, RDM (우물 당 1 mL)을 사용 하 여 매체를 변경 CHIR99021. 1.2 단계에서 설명 하는 주식에서 추가할 activin A, 10 µ L의 수 5402, 및 CHIR99021의 3 µ L의 10 µ L RDM의 10 mL. 4. RPE의 통로 0에 농축 하루 코트 6 잘 플레이트 성장 인자와 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH를 감소. 또는 하룻밤 4 실 온에서 1 h에 대 한 설정 하려면 허용 ° c. 약 수 필요한 DPBS의 볼륨과 RDM의 농축 및 37 물 욕조에 따뜻한 음 당 1 mL ° C. 가져와 37의 실내 온도 따뜻한 필요한 볼륨 RSM, 항균 약, 및 Y-27632의 TDE ° c. 추가 항균 성 시 약 그리고 Y-27632 0.5 x 및 RSM 각각 10 µ M 작곡. 첫 번째 4-7 일 동안이 매체를 사용 하 여 첨부 파일을 개선. Aspirate 지출된 매체에서 우물 및 미리 따뜻하게 RDM (성장 인자 필요)의 당 1 mL을 추가. 해 현미경을 사용 하 여 수동으로 해 부와 P10 피펫으로 팁을 사용 하 여 모든 비 RPE 세포 떨어져 다쳤어요. 참고: 예의 대표적인 결과 섹션을 참조 하십시오. RDM 발음 해 부, 후와 모든 파편 세포. 잘 당 미리 따뜻하게 DPBS의 1 mL로 두 번 세척. 12-잘 접시의 당 TDE의 0.5 mL을 추가 하 고 5 분 부드럽게 접시에서 셀을 제거 하려면 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 37 ° C에서 품 어. P1000 피펫으로 부드럽게 셀/TDE 정지를 3-4 회를 위아래로 pipetting으로 triturate를 사용 하 여 균일 한 현 탁 액을 만듭니다. 셀/TDE 정지 Y-27632 없이 미리 따뜻하게 RSM에 1시 10분 희석. 실 온에서 5 분 동안 173 x g에 세포 현 탁 액을 원심. 발음 셀 펠 릿에서 매체와 10 µ M와 RSM에 셀 resuspend Y-27632 (1 mL 당 잘 농축). 변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산. 씨 셀 성장 인자 감소 ECM 코팅 플레이트 1 x 10 5 셀/cm 2 10 µ M와 RSM의 4 mL Y-27632. 10 µ M는 RSM 바꿉니다 Y-27632 셀 시드 후 48 h 대체 미디어 (예: 월요일과 목요일에) 매 3-4 일을 계속. 10 µ M를 교체 하지 마십시오 4-7 일 후 Y-27632. 37 ° C, 5% CO 2 28 ~ 35 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 대체는 RSM 매 3-4 일 (예: 월요일과 목요일에) 계속. 5. 성숙: 통로 1과 2의 RPE 참고: 괄호로 표시 된 볼륨의 6 잘 플레이트 또는 T75 플라스 크 1에 대 한 표시 됩니다. 통로 0의 28 ~ 35 일 사이 코트 제조 업체의 권장 사항에 따라 ECMH와 6 잘 플레이트 (T75 플라스 크). 약 수 DPBS 볼륨 RSM 필요 하 고 37 물 욕조에 따뜻한 실내 온도에 ° C.가지고 TDE. Aspirate 우물에서 매체와 세척 잘 두 번와 함께 보낸 미리 따뜻하게 DPBS의 2ml (10 mL). 참고: 10 µ M를 사용 하지 마십시오 Y-27632. 발음 DPBS TDE의 1 mL (5 mL)을 추가 하 고. 5 분 동안 37 ° C, 5% CO 2 배양 기에 넣습니다. 부 화, 후 보기 세포 세포를 확인 하는 거꾸로 한 현미경에 계약 하 분리. 부드럽게 잘 또는 플라스 크의 밑면에서 셀을 제거는 적절 한 크기의 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여. P1000 팁 (10 mL 혈 청 학적인 피펫으로)를 사용 하 여 부드럽게 triturate 셀/TDE 정지 아래로 3-4 회를 균일 한 현 탁 액을 만듭니다. 는 RSM에 셀 서 스 펜 션 1시 10분 희석. 린스 잘/플라스 크 희석된 세포 현 탁 액에 추가 하는 RSM의 2 mL (5 mL)을 예약. 참고: 초과 25 분 효소 노출 시간을 허용 하지 않습니다 173 x g 실 온에서 5 분 동안에 세포 현 탁 액을 원심. 셀 펠 릿에서 매체를 발음 하 고 RSM의 1 mL (5 mL)에 셀 resuspend 변형 40 µ m 모와 나일론 메쉬 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀. hemocytometer를 사용 하 여 지정 된 볼륨에 있는 셀의 수를 계산 하 고 긴장 된 솔루션에 있는 세포의 농도 계산. 1 x 10 5 셀/cm 2 4 mL (15 mL) RSM의 ECMH 코팅 접시에 셀 씨. 30 일 동안 성숙 하기 위하여 셀 수 있습니다. 변화는 RSM 3-4 일 마다 계속. 하루 30 구절 구절 1 ~ 2에서에서 셀에 위의 절차 (단계 5.2-5.11)을 반복. 6. 중간 셀 은행 만들기:의 Cryopreservation 통로 2 일 3-5 RPE 참고: subconfluent (50%) 이며, 안료를 회복 하지는 하는 동안 셀 Cryopreserve. Cryopreservation 매체의 볼륨 10% DMSO 3 x 10 6 셀/mL의 농도에서 세포를 resuspend 하는 데 필요한 계산 셀의 수에 따라,. 수행 단계 5.2 5.8입니다. 3 x 10 6 셀/mL에 10 %DMSO cryopreservation 매체에 셀 펠 릿 resuspend 고 1.2 mL 극저온 튜브에 세포 현 탁 액 1 mL. -1 ° C/min에서 멋진 하룻밤-80 ° C에서 배치 하는 설계 된 냉동 컨테이너에 극저온 튜브를 배치 합니다. 장기 저장을 위한 액체 질소에 전송. 참고: 이러한 셀 녹고 시 통로 3 될 것입니다. 셀을 특성화 하기 전에 30 일에 대 한 문화. 씨앗 통로 3 RPE 1.5 x 10에서 5 cm 2 녹고 시 당. 2 , 4 , 6 , 7