في فيفو تتبع البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة في نموذج الفئران هشاشة العظام ركبة مع صبغ الغشاء محبتين نيون
Summary
ويصف هذا البروتوكول وسيلة فعالة لرصد استمرار الخلايا وبيوديستريبوشن البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة (هامسكس) التي استعملنا fluorescence تسمية في نموذج الفئران ركبة هشاشة العظام (كوا) عن طريق الحقن (IA) داخل المفصل.
Abstract
وبغية دعم التطبيق السريري للبشرية المستمدة من الدهنية الوسيطة (هامسك) العلاج بالخلايا الجذعية للركبة هشاشة العظام (كوا)، قمنا بدراسة فعالية استمرار الخلايا وبيوديستريبوشن من هامسكس في نماذج حيوانية. أظهرنا أسلوب تسمية غشاء الخلية هامسكس بصبغة الفلورسنت محبتين. في وقت لاحق، تم رصد الحقن داخل المفصل للخلايا المسماة في الفئران مع كوا جراحيا المستحث بشكل حيوي في فيفو نظام التصوير. نحن العاملين في محبتين كاربوسيانينيس هل (ديلك18 (5))، النظير ديل (ديالكيلكاربوسيانينيس) استعملنا فلورسنت، والتي تستخدم ليزر أحمر لتجنب إثارة أوتوفلوريسسينسي الخضراء الطبيعية من الأنسجة المحيطة. وعلاوة على ذلك، يسمح أطياف الانبعاث تحول الأحمر لتصوير الأنسجة العميقة في الحيوانات الحية وإجراءات وضع العلامات ولم تتسبب الآثار السامة للخلايا أو الأضرار الوظيفية إلى هامسكس. هذا النهج قد ثبت أن أسلوب تعقب تتسم بكفاءة هامسكس في نموذج كوا الفئران. كما يمكن تطبيق هذا الأسلوب لتحديد مسار الإدارة المثلى وجرعة MSCs من مصادر أخرى في الدراسات ما قبل السريرية.
Introduction
فصال الركبة (كوا) هو اضطراب التنكسية الناتجة عن فقدان الغضروف المفصلي والتهاب التدريجي، الذي أصبح أمراض مزمنة رئيسية لدى كبار السن في جميع أنحاء العالم1. ومع ذلك، قد فقط توفر العلاجات الحالية باستخدام العقاقير المضادة للالتهابات، والمكملات الغذائية المادية، والعمليات الجراحية الإغاثة المؤقتة للأعراض الألم2.
وأصبحت البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة (هامسكس) علاج التجدد واعدة لهشاشة العظام الركبة، سبب عن التمايز multipotent المحتملة لتجديد الغضاريف و خصائص إيمونومودولاتوري3، 4. بالمقارنة مع الطرق الدوائية للتحقيق وآليات للعمل في فيفو، تتبع هامسكس يعيش في نماذج حيوانية كوا الصغيرة حاليا من المفيد أن تضع مبررات وجدوى العلاج هامسك قبل التطبيق السريري. للتجارب الإكلينيكية، يزعزع مينيسسيكتومي الآنسي (مم) تحميل الميكانيكية المشتركة لحمل كوا في الفئران، الذي يقدم نموذجا عمليا نسبيا مع إمكانية تكرار نتائج متسقة5. بداية كوا الناجم عن مم أقدم من الرباط الصليبي الأمامي ترانسيكشن منفردة أو مجتمعة مع مينيسسيكتومي الآنسي الجزئي6. ولذلك، غالباً ما يتم تقييم التفاعلات طويلة الأجل بين هامسكس حقن مع المكروية المرضية من كوا في الفئران التي تسببها ملم7،8.
على الرغم من الفعالية العلاجية من هامسكس كانت المعارف ذات الصلة المبلغ عنها على نطاق واسع، وعلى استمرار في فيفو هامسكس مزروع عن طريق الحقن (IA) داخل المفصل هو ندرة9،10. ومن ثم، مختلف أساليب وصفها الخلوية وقد وضعت، بما في ذلك إيمونوهيستولوجي11، لوسيفراس12،13 بروتين فلوري أخضر تعداء، أكسيد الحديد وسم للتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي)14 ، و عديدة الخلية الفلورية الأصباغ،8،15،16. بالمقارنة مع تحاليل الأنسجة كثيفة العمالة، توظف في فيفو تصوير غير الغازية الأجهزة البصرية للكشف عن التوزيع في الوقت الحقيقي، وديناميات الخلايا المسماة بإشارات الفلورسنت10،17. لتصوير الخلية الحية الوظيفية، وضع العلامات الفلورية سيتوكومباتيبلي تقنية متطورة تتبع خالية من المشعة للكشف عن الأنشطة الخلوية بعد زرع الخلايا الجذعية18. وعلاوة على ذلك، تمتلك متعدد الألوان الفلورية الأصباغ محبتين مزايا أكثر من الأصباغ ماء الأمينية المتفاعلة أو البروتينات الفلورية، نفاذية الخلية المحسنة والأسفار المحسن الكم غلة19.
وهكذا، تستخدم البروتوكولات المضمنة هنا حمراء ليزر لإثارة الخلايا المسماة محبتين كاربوسيانينيس فعل (ديلك18(5))، وهو استعملنا فلورسنت ديل (ديالكيلكاربوسيانينيس) تناظرية20. يتجنب التدخل أوتوفلوريسسينت الأطياف الإثارة والانبعاثات تحول الأحمر من ويسمح التصوير على مدى فترة طويلة من الزمن في الحيوانات الحية8الأنسجة العميقة. هذا الأسلوب لتتبع الخلايا في الجسم الحي المسمى بهل صالحة للرصد زرع الخلايا الجذعية، مثل هامسكس، في نماذج حيوانية، هو أمر أساسي لفهم وتحسين العلاج التجديدي الخلايا الجذعية الحالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
معايير السلامة والدراسات بيوديستريبوشن للعلاج بالخلايا الجذعية هناك حاجة ماسة قبل أن يمكن أن نأتي علاج الخلايا الجذعية التجدد كوا من على مقاعد البدلاء للسرير. ومع ذلك، البيئة المرضية للمرض دوراً هاما في استمرار وبيوديستريبوشن من هامسكس زرع10. في الآونة الأخيرة، أثبتت مجموعت…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة الحالية “شانغهاي تمويل الابتكار” (1402 ه 294300) برعاية العلوم والتكنولوجيا اللجنة من شانغهاي بلدية (CN) للدكتور وانغ ون. ونود أن نشكر “الدكتور قوانغدونغ تشو” (الوطنية الأنسجة الهندسة مركز الصين) لتقديم المساعدة التقنية والمشورة العلمية لهذه المخطوطة. كما نود أن نشكر السيد هويتانج شيا (مستشفى شانغهاي التاسعة الشعبية) لمساعدته في رعاية الحيوان.
Materials
| Matrx VMR animal anesthesia system | Midmark | VIP3000 | |
| 4-0 suture | Shanghai Jinhuan | KC439 | |
| Razor | Pritech | LD-9987 | |
| Gentamicin | Zhejiang Jindakang Animal Health Product Co., Ltd. | None | |
| 0.9% Sodium chloride solution | Hunan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd. | H43020455 | |
| Penicillin | Shanghai Kangfu chemical pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Buprenorphine | Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd. | None | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005 | Dilute to final concentration of 10% in PBS |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | Dilute to final concentration of 20% in PBS |
| 0.1% Hematoxylin Solution, Mayer’s | Sigma-Aldrich | MHS16 | |
| 0.5% Eosin Y solution, alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110116 | |
| Safranin O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Shandon Excelsior ESTM Tissue Processor | Thermo Fisher | A78400006 | |
| Shandon Histocentre™ 3 Tissue Embedding Center | Thermo Fisher | B64100010 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| DiD | Molecular Probes, Life Technologies |
V-22887 | |
| D-MEM High Glucose | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| PBS | GIBCO, Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200-114 | |
| 10 cm Petri Dish | Corning | V118877 | |
| Centrifuge | Beckman | Optima MAX-TL | |
| Fluorescent microscope | Olympus | BX53 | |
| 0.4% Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Titetamme | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Zolazepam | Virbac (Zoletil 50) | 1000000188 | |
| Sterile hyposermic syringe for single use 26G | Shanghai Misawa Medical Industry | None | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | 124262 | |
| Living Imaging 4.0 software | PerkinElmer | None |
Referenzen
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- Lane, N. E., Shidara, K., Wise, B. L. Osteoarthritis year in review 2016: clinical. Osteoarthritis Cartilage. 25 (2), 209-215 (2017).
- Wang, W., Cao, W. Treatment of osteoarthritis with mesenchymal stem cells. Sci China Life Sci. 57 (6), 586-595 (2014).
- Burke, J., et al. Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clin Transl Med. 5 (1), 27 (2016).
- Bendele, A. M. Animal models of osteoarthritis. J Musculoskelet Neuronal Interact. 1 (4), 363-376 (2001).
- Gerwin, N., Bendele, A. M., Glasson, S., Carlson, C. S. The OARSI histopathology initiative – recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the rat. Osteoarthritis Cartilage. 18, S24-S34 (2010).
- Janusz, M. J., et al. Induction of osteoarthritis in the rat by surgical tear of the meniscus: Inhibition of joint damage by a matrix metalloproteinase inhibitor. Osteoarthritis Cartilage. 10 (10), 785-791 (2002).
- Li, M., et al. In vivo human adipose-derived mesenchymal stem cell tracking after intra-articular delivery in a rat osteoarthritis model. Stem Cell Res Ther. 7 (1), 160 (2016).
- Zhou, B., et al. Administering human adipose-derived mesenchymal stem cells to prevent and treat experimental arthritis. Clin Immunol. 141 (3), 328-337 (2011).
- Desando, G., et al. Intra-articular delivery of adipose derived stromal cells attenuates osteoarthritis progression in an experimental rabbit model. Arthritis Res Ther. 15 (1), 22 (2013).
- Riester, S. M., et al. Safety Studies for Use of Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells in a Rabbit Model for Osteoarthritis to Support a Phase I Clinical Trial. Stem Cells Transl Med. 6 (3), 910-922 (2017).
- Bai, X., et al. Tracking long-term survival of intramyocardially delivered human adipose tissue-derived stem cells using bioluminescence imaging. Mol Imaging Biol. 13 (4), 633-645 (2011).
- Wolbank, S., et al. Labelling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking. Cell Tissue Bank. 8 (3), 163-177 (2007).
- Heymer, A., et al. Iron oxide labelling of human mesenchymal stem cells in collagen hydrogels for articular cartilage repair. Biomaterials. 29 (10), 1473-1483 (2008).
- Hemmrich, K., Meersch, M., von Heimburg, D., Pallua, N. Applicability of the dyes CFSE, CM-DiI and PKH26 for tracking of human preadipocytes to evaluate adipose tissue engineering. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 117-127 (2006).
- Shim, G., et al. Pharmacokinetics and in vivo fate of intra-articularly transplanted human bone marrow-derived clonal mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 24 (9), 1124-1132 (2015).
- Chen, B. K., et al. A safety study on intrathecal delivery of autologous mesenchymal stromal cells in rabbits directly supporting Phase I human trials. Transfusion. 55 (5), 1013-1020 (2015).
- Chan, M. M., Gray, B. D., Pak, K. Y., Fong, D. Non-invasive in vivo imaging of arthritis in a collagen-induced murine model with phosphatidylserine-binding near-infrared (NIR) dye. Arthritis Res Ther. 17, 50 (2015).
- Texier, I., et al. Cyanine-loaded lipid nanoparticles for improved in vivo fluorescence imaging. J Biomed Opt. 14 (5), 054005 (2009).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Rahmati, M., Mobasheri, A., Mozafari, M. Inflammatory mediators in osteoarthritis: A critical review of the state-of-the-art, current prospects, and future challenges. Bone. 85, 81-90 (2016).
- Detante, O., et al. Intravenous administration of 99mTc-HMPAO-labeled human mesenchymal stem cells after stroke: in vivo imaging and biodistribution. Cell Transplant. 18 (12), 1369-1379 (2009).
- Hu, S. L., et al. In vivo magnetic resonance imaging tracking of SPIO-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 113 (3), 1005-1012 (2012).
- Xia, Q., et al. Intra-articular transplantation of atsttrin-transduced mesenchymal stem cells ameliorate osteoarthritis development. Stem Cells Transl Med. 4 (5), 523-531 (2015).
- Jasmin, , et al. Optimized labeling of bone marrow mesenchymal cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and in vivo visualization by magnetic resonance imaging. J Nanobiotechnology. 9, 4 (2011).
- Lehmann, T. P., et al. Coculture of human nucleus pulposus cells with multipotent mesenchymal stromal cells from human bone marrow reveals formation of tunnelling nanotubes. Mol Med Rep. 9 (2), 574-582 (2014).
- Wang, W., et al. Human adipose-derived mesenchymal progenitor cells engraft into rabbit articular cartilage. Int J Mol Sci. 16 (6), 12076-12091 (2015).
