В естественных условиях Assay для обнаружения антиген специфические Т-лимфоцитов цитолитического функции с помощью вакцинации модели
Summary
Целью настоящего Протокола является возможность для обнаружения в vivo антиген специфические убийство из целевой ячейки в мышиных модели.
Abstract
Текущей методологии антиген специфические убийство ограничены для использования в пробирке или использованы в модели инфекционных заболеваний. Однако это не протокол, специально предназначенные для измерения антиген специфические убийство без инфекции. Этот протокол разработан и описывает методы, чтобы преодолеть эти ограничения, позволяя для обнаружения антиген специфические убийство из целевой ячейки, CD8+ T-клеток в vivo. Это достигается путем слияния с традиционной CFSE-меченых целевого убийства пробирного модель вакцинации. Эта комбинация позволяет исследователю оценить потенциал CTL антиген специфические прямо и быстро, как assay не зависит от роста опухоли или инфекции. Кроме того индикация основана на проточной цитометрии и поэтому должно быть легко доступной для большинства исследователей. Главное ограничение этого исследования является определение timeline в естественных условиях , соответствующий гипотеза тестируется. Вариации численности антигена и мутации в Т-клеток, которые могут привести к дифференциальной цитолитических функции необходимо тщательно оценивать определить оптимальное время для клеток урожай и оценки. Соответствующей концентрации пептидные для вакцинации был оптимизирован для hgp10025-33 и OVA257-264, но потребуются дополнительные проверки для других пептидов, которые могут быть более подходящим для данного исследования. В целом этот протокол позволяет быстро оценки убийстве функции в естественных условиях и может быть адаптирована к любой данной антигена.
Introduction
Множественные протоколы существуют для оценки цитолитических (CTL) потенциал CD8+ или CD4+ Т-клеток. Эта оценка может быть легко сделано в пробирке в контролируемых условиях1,2,3. Кроме того, модели инфекционных заболеваний, таких как LCMV, классически изучили CTL функции с использованием дифференциально CFSE (5-(and 6)-Карбоксифлуоресцеина диацетата succinimidyl эфира) помечены клетки-мишени где CFSEПривет-помечены клетки пульсирующий с пептида и CFSEЛо-обозначенные цели, клетки остаются unpulsed. Клетки затем вводят в соотношении 1:1 и оценены за потерю CFSEПривет-обозначены потока цитометрии4импульсных цели. Вакцины и неприятие модели также использовали аналогичные стратегии для оценки в vivo убивает обоих CD8+ и CD4 клеток+ T также, как NK клеток5,6. Это мощный пробирного, но требует использования инфекционных агентов, которые премьер иммунной системы до целевой инъекций.
Этот протокол, с другой стороны, требует не ранее инфекция хоста и вместо этого использует стратегию вакцинации премьер иммунной системы до целевой инъекций. Этот вакцинации состоит из водной основе разработки вакцины пептид, который требует предоставления иммуностимулирующее коктейль называется covax7, состоящая из Толл подобный рецептор 7 (TLR7) агонистов (Имиквимод крем), агонистических анти CD40 антитела и интерлейкин-2 (IL-2), ведущих к синергетического сочетание иммуностимулирующее агентов для выхода грунтование пептид конкретных и надежных иммунной реакции. Таким образом этот assay обеспечивает быстрый индикация CTL функции как вакцина осуществляется наряду с клетки для оценки функции только за три дня до инъекции клеток-мишеней. Кроме того covax грунт достаточно сильны, что убийство потенциала загрунтовать антиген специфические Т-клеток можно увидеть между 4 и 24 ч после инъекции.
Главное ограничение этого протокола является определение шкалы времени в естественных условиях для обнаружения целевого убийства, подходящим для антигена и гипотеза тестируется. Внимательны, что оценки должны быть выполнены, как различия в силу антиген, а также генетические изменения испытывается в Т-клеток может привести к дифференциальной функции CTL, которая потребует различных сроков обнаружения целевого убийства. Кроме того, в то время как соответствующие концентрация пептидный для вакцинации был оптимизирован для человека меланомы антигена гликопептидных 100 (hgp10025-33) и овальбумина257-264 (OVA257-264)8,9 , использование другого антиген модель, которая может быть более подходящим для данного исследования потребует дальнейшей проверки. Из-за ожидаемых различий в целевой антигены способность стимулировать CTL эффекторные функции в сочетании с covax как вспомогательное средство оптимизация IL-2 дозе концентрации дозы и частоты может быть необходимо для достижения желаемой цели. В целом этот протокол позволяет для быстрой оценки убийстве функции в естественных условиях и может быть адаптирована к любой данной антигена.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя этот протокол является простым, есть несколько важных шагов, которые должны тщательно выполняться. Covax грунтовка, после инъекции антиген специфические Т-клеток проходит проверку необходимо увидеть любые убийства импульсного целей. Хотя вполне возможно, что на водной основе covax ва?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается низ исследования (A1R03AI120027 (RN) и 1R21AI20012 (RN)), Грант институциональных исследований (RN), начальный Грант (RN) и MD Андерсон CIC семенного предоставлении (RN).
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
Referenzen
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
