在体内应用免疫模型检测抗原特异性 T 细胞细胞功能的试验
Summary
该协议的目标是允许检测在小鼠模型中的靶细胞的体内抗原特异性杀伤。
Abstract
目前用于抗原特异性致死的方法仅限于在感染性疾病模型中使用或应用于体外。然而, 没有一项专门用于测量不感染抗原特异的杀伤的协议。本协议设计并描述了克服这些限制的方法, 允许通过 CD8+ T 细胞体内检测目标细胞的抗原特异性杀伤。这是通过将疫苗接种模型与传统的 CFSE 标靶杀伤试验结合起来完成的。这种结合使研究人员能够直接和快速地评估抗原特异的 CTL 电位, 因为这种检测不依赖于肿瘤的生长或感染。此外, 读数是基于流式细胞仪, 因此应该容易接近大多数研究员。该研究的主要限制是确定适合于所测试的假设的时间轴在体内。在 T 细胞的抗原强度和突变的变化, 可能导致差异细胞功能需要仔细评估, 以确定最佳时间的细胞收获和评估。对于 hgp10025-33和卵子257-264, 已优化了用于疫苗接种的适当浓度的肽, 但对于可能更适合于特定研究的其他肽, 则需要进一步验证。总的来说, 该协议允许快速评估杀死功能在体内, 可以适应任何给定的抗原。
Introduction
存在多个协议来评估 CD8+或 CD4+ T 单元格的细胞 (CTL) 电位。这种评估可以很容易地做在体外在受控条件下1,2,3。此外, 传染病模型, 如 LCMV, 通过使用差异 CFSE (5-(和 6)-羧基双乙酸琥珀酰亚胺酯) 对 CTL 功能进行了经典的检查, 标记为 CFSEhi标记的单元格的目标单元格脉冲与多肽和 CFSElo标记的目标细胞是左 unpulsed。然后, 以1:1 的比率注入细胞, 并通过流式细胞仪4对 CFSEhi标记的脉冲目标的丢失进行评估。疫苗和排斥模型也使用类似的策略, 评估的在体内杀害的 CD8+和 CD4+ T 细胞以及 NK 细胞5,6。这是一个强有力的化验, 但需要使用的传染性药物, 在靶注射前免疫系统的首要。
这个协议, 另一方面, 不需要事先感染的主机, 而是利用疫苗接种策略, 以在目标注射前的免疫系统的首要。这种疫苗接种是由多肽疫苗的水基配方, 需要提供一种免疫鸡尾酒称为 covax7, 由 Toll 样受体 7 (TLR7) 激动剂 (莫特霜), 竞赛 anti-CD40抗体和 interleukin-2 (IL-2) 导致免疫剂的协同组合, 以诱导肽特异性启动和强健的免疫应答。因此, 这种化验提供了一个 CTL 功能的快速读数, 因为疫苗是在注射靶细胞前的三天内与细胞一起进行功能评估的。此外, covax 启动足够强, 注射后的抗原特异性 T 细胞的杀伤能力可以看到4和24小时。
该协议的主要限制是确定时间轴在体内检测目标杀死, 这是适当的抗原和假设被测试。必须进行仔细的评估, 因为抗原强度的变化以及在 T 细胞中测试的基因改变可能会导致不同的 CTL 功能, 这就需要对目标杀伤的定时检测。此外, 虽然适当浓度的肽接种已优化人类黑色素瘤抗原糖 100 (hgp10025-33) 和蛋白257-264 (卵257-264)8,9 ,使用另一个可能更适合于某项研究的抗原模型将需要进一步验证。由于预期的目标抗原的能力, 以刺激 CTL 效应功能与 covax 作为佐剂, 优化 IL-2 剂量浓度和剂量频率可能是必不可少的, 以达到预期的目标。总的来说, 该协议允许快速评估杀死功能在体内, 可以适应任何给定的抗原。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然该协议很简单, 但还有一些关键步骤必须仔细执行。covax 注射后的抗原特异性 T 细胞被测试是必要的, 看到任何杀害的脉冲目标。虽然水基 covax 疫苗可能造成急性炎症状态, 为慢性炎症阶段, 取代短命的水基配方与缓慢抗原释放油的方法可能会产生更好的结果7,12。
此外, 对于理想的流式细胞仪, 在抗原脉冲后的靶细胞的 CFSE 标记?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到 NIH 研究 (A1R03AI120027 (rn) 和 1R21AI20012 (rn)), 机构研究补助金 (rn), 启动补助金 (rn) 和 MD 安德森 CIC 种子补助金 (rn) 的支持。
Materials
| 6- to 12-week old female C57BL/6 mice | Charles River | 027 | C57 Black 6 mice |
| OT-1 6-12-week old female mice | Jackson Labs | 003831 | |
| hgp10025–33 | CPCScientific | 834139 | KVPRNQDWL |
| OVA 257–264 | CPCScientific | MISC-012 | SIINFEKL |
| Imiquimod cream 5% | Fougera | 51672-4145-6 | Aldara Cream |
| CD40-specific mAb | BioXcell | BE0016-2 | clone FGK4.5 |
| rhIL-2 protein | Hoffman LaRoche Inc | 136 | Recombinant human IL-2 protein |
| 70% isopropyl alcohol Prep | Kendall | S-17474 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | Phosphate Buffered Saline |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | fetal bovine serum |
| RBC lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | red blood cell lysis buffer |
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | penicillin/streptomycin |
| CFSE | Life Technologies | C34554 | 5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
| 1.5 mL MCT graduated natural | Fisher | 05-408-129 | microcentrifuge tube |
| 70% ethanol | Fisher | BP8201500 | EtOH |
| Trypan blue solution, 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | |
| 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 |
Referenzen
- Liu, L., et al. Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).
- Wherry, E. J., et al. Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets. Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).
- He, L., et al. A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells. J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).
- Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells. J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Johansson, S., et al. Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules. J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).
- Overwijk, W. W., et al. Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells. J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).
- Cho, H. I., Celis, E. Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects. Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).
- Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy. Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Durward, M., Harms, J., Splitter, G. Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells. J Vis Exp. (45), (2010).
