可視化とアデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト オルガネラのライブ イメージング

脳の白質は神経細胞の軸索が髄鞘、オリゴデンドロ サイトによって形成された特殊な拡張プラズマ膜に包まれたので構成されます。髄鞘が高速かつ信頼性の高い活動電位伝搬と有髄軸索の長期的な生存のため必要と髄鞘の損失は、神経機能障害を引き起こす可能性が。その重要性にもかかわらずオリゴデンドロ サイトのプロパティは、あまり知られてに比べニューロンとアストロ サイト。その結果、オリゴデンドロ サイトを勉強の少ないツールを開発されています。

生きるイメージング細胞小器官のミトコンドリア、endoplasmatic 小胞体 (ER) や小胞構造の異なる時間の経過とともに細胞小器官のダイナミックな変化を研究することができます。伝統的に、リビングのオリゴデンドロ サイトのイメージングをモノカルチャー^1,2で行った。単作のオリゴデンドロ サイトはコンパクトなミエリンを表示しないし、切片または急性脳スライスが、局在と細胞内小器官の動きを勉強するときにしたがってより良いオプションをことがあります。細胞小器官と髄鞘蛋白の局在は有髄の軸索と周囲の髄鞘の間の短い距離のために挑戦することができます。したがって、光顕微鏡による免疫染色の手順だけでは、有髄軸索のミエリン鞘の細胞小器官とを区別するため空間分解能を持っていません。これは、細胞型-特異的発現プロモーターによって駆動される細胞小器官をターゲットとした蛍光タンパク質の遺伝子をウイルスの伝達によって解決できます。利点は、オルガネラ局在とダイナミクスの正確な評価を可能にする細胞特異とスパース表現です。トランスジェニック動物は、このような細胞小器官をターゲットとしたセル固有の式³を達成するためにも使用できます。しかし、生産やトランスジェニック動物のメンテナンスは高価です、通常ウイルスの方法によって達成することができますスパース表現を提供していません。

記載されているメソッドはここ (MBP 水戸下流か MBP 水戸 GFP) を視覚化するミエリン塩基性タンパク質プロモーターによって駆動されるミトコンドリアをターゲットとした蛍光蛋白質 (下流または緑色蛍光タンパク質 GFP) とオリゴデンドロ サイトのウイルスの伝達を使用します。脊髄脳スライスにおけるオリゴデンドロ サイト ミトコンドリア。さらに、別の蛍光蛋白質 (GFP 水戸した dsred と併用または水戸 GFP を使用 tdtomato) 細胞質内の式は、髄鞘の細胞コンパートメントを含む細胞形態の可視化を有効にするためです。プロトコルには、脊髄の脳のスライス (・ デ ・ シモーニとゆう、2006年^4,5で記述されたプロトコルの修正されたバージョン) を行うための手順が含まれています。我々 はミトコンドリアの動きを研究するためタイムラプス イメージング手順を説明します。この手順は、イメージング メディア、イメージング中に薬やその他の媒体の変更の簡単なアプリケーションを可能にするセットアップの継続的な交流と直立した共焦点顕微鏡を使用します。タイムラプス イメージング手順は、以下のように生活のスライスを維持するためのいくつかの余分な機器と、共焦点顕微鏡で実行できます。プロトコルには、画像を最適化し、毒性を削減するいくつかのヒントも含まれています。

最後に、共焦点反射顕微鏡 (コア) 無染色ミエリンを視覚化するための迅速かつ簡単な方法を説明します。これは、ライブ イメージング中に髄鞘を識別することができます。近年、いくつかのテクニックは、必要な任意の染色することがなくイメージ ミエリンに開発されているが、これらのほとんどは、特定機器と専門知識^6,7,8を必要とします。ここで説明する手順ミエリン鞘の反射のプロパティを使用して、分光共焦点の顕微鏡検査の簡略化された単一励起波長バージョン (スコアは、いくつかのレーザーの波長はミエリンを視覚化する結合されます)⁹. コアは、488 nm レーザーと 470 500 nm バンドパス排出フィルターまたは可変発光フィルター、共焦点顕微鏡で行うことができます。