Visualisation et l’imagerie direct des oligodendrocytes Organelles dans des tranches de cerveau organotypique utilisant Virus Adeno-associé et microscopie confocale
Summary
Oligodendrocytes myélinisantes favorisent la propagation du potentiel d’action rapide et la survie des neurones. Décrit ici est un protocole pour l’expression des protéines fluorescentes dans organotypique oligodendrocyte spécifique des tranches de cerveau avec l’imagerie Time-lapse ultérieur. En outre, une procédure simple pour la visualisation de la myéline non-colorées est présentée.
Abstract
Les neurones dépendent de l’isolation électrique et le soutien trophique des oligodendrocytes myélinisantes. Malgré l’importance des oligodendrocytes, les outils avancés actuellement utilisés pour étudier les neurones, en partie seulement ont été prises par des chercheurs de l’oligodendrocyte. Cellule spécifique au type de coloration par transduction virale est une approche utile pour étudier la dynamique de l’organite direct. Cet article décrit un protocole pour la visualisation des mitochondries des oligodendrocytes dans des tranches de cerveau organotypique de transduction avec adeno-associated virus (AAV) transportant des gènes mitochondries protéines fluorescentes ciblés sous le contrôle transcriptionnel de le promoteur de la protéine basique de la myéline. Il inclut le protocole pour faire des coupes de cerveau de souris coronale organotypique. Une procédure de Time-lapse imagerie des mitochondries puis suit. Ces méthodes peuvent être transférées vers les autres organites et peuvent être particulièrement utiles pour l’étude des organites dans la gaine de myéline. Enfin, nous décrivons une technique facilement accessible pour la visualisation de la myéline non colorée dans des tranches de vie par microscopie confocale réflectance (CoRe). Noyau a besoin d’aucun équipement supplémentaire et peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live.
Introduction
La substance blanche du cerveau se compose des axones des cellules nerveuses enveloppés dans la myéline, une plasmalemme étendu spécialisé formé par les oligodendrocytes. La myéline est nécessaire pour la propagation du potentiel d’action rapide et fiable et une survie à long terme des axones myélinisés, et une perte de la myéline peut provoquer des dysfonctionnements neurologiques. Malgré leur importance, les propriétés des oligodendrocytes sont moins connues comparées avec les neurones et les astrocytes. Par conséquent, moins d’outils ont été développés pour l’étude des oligodendrocytes.
Vivre l’imagerie des organites cellulaires tels que les mitochondries, le réticulum endoplasmatic (ER) ou différentes structures vésiculaires peuvent être utiles d’étudier les changements dynamiques dans les organites au fil du temps. Traditionnellement, l’imagerie des oligodendrocytes vivant a été réalisée en monocultures1,2. Cependant, oligodendrocytes en monoculture n’affichent pas de myéline compacte et organotypique ou tranches de cerveau aiguë peuvent, par conséquent, être une meilleure option lorsque l’on étudie le mouvement des organites et localisation. Localisation de petits organites et de protéines de la gaine de myéline peut être difficile en raison de la courte distance entre les axones myélinisés et la gaine de myéline environnante. Ainsi, lumière immunostaining microscopiques procédures seul n’ont pas la résolution spatiale d’établir une distinction entre les organites dans la gaine de myéline et ceux dans les axones myélinisés. Cela peut être résolu par transduction virale avec des gènes codant pour des protéines fluorescentes organelle ciblées grâce aux promoteurs spécifiques à un type de cellule. Les avantages sont une expression spécifique des cellules et éparse, qui permet une évaluation précise de la localisation de l’organite et dynamique. Animaux transgéniques permet également d’atteindre telle une ciblées organite spécifique des cellules expression3. Cependant, la production et l’entretien des animaux transgéniques est coûteux et habituellement n’offre pas l’expression rare qui peut être obtenue par des méthodes virales.
La méthode décrite ici utilise la transduction virale des oligodendrocytes avec mitochondrial ciblée des protéines fluorescentes (dsred ou vert fluorescent protéine GFP) conduit par le promoteur de la protéine basique de la myéline (MBP-mito-dsred ou MBP-mito-GFP) pour visualiser mitochondries dans des tranches de cerveau organotypique oligodendrocyte. En outre, l’expression d’une protéine fluorescente dans le cytoplasme (GFP utilisé conjointement avec mito-dsred ou tdtomato utilisé avec mito-GFP) est utilisée pour permettre la visualisation de la morphologie cellulaire, y compris les compartiments cytoplasmiques de la gaine de myéline. Le protocole prévoit la procédure pour faire des coupes de cerveau d’organotypique (une version modifiée du protocole décrit par De Simoni et Yu, 20064,,5). Nous décrivons ensuite la procédure d’imagerie Time-lapse pour étudier le mouvement mitochondriale. Cette procédure utilise un microscope confocal vertical avec un échange continu d’imagerie moyen, une installation qui permet une application facile de drogues ou d’autres modifications moyennes pendant la formation image. La procédure d’imagerie Time-lapse peut être effectuée sur n’importe quel microscope confocal, avec certains équipements supplémentaires pour le maintien des tranches de vie tel que décrit ci-dessous. Le protocole contient également plusieurs conseils pour optimiser l’imagerie et de réduire de phototoxicité.
Enfin, un moyen simple et rapide de visualiser la myéline non-colorées par microscopie confocale réflectance (CoRe) est décrite. Cela peut être utile pour identifier la gaine de myéline pendant la formation image live. Ces dernières années, plusieurs techniques ont été développées à la myéline image sans aucune coloration requise, mais la plupart d’entre eux nécessite des équipements et l’expertise6,7,8. La procédure décrite ici utilise les propriétés réfléchissantes de la gaine de myéline et est une version simplifiée unique-excitation d’onde de la microscopie confocale facteur de réflexion spectrale (SCoRe, dans lequel plusieurs laser des longueurs d’onde est combinés afin de visualiser la myéline) 9. coRe peut être fait sur n’importe quel microscope confocal disposant d’un laser à 488 nm et un filtre d’émission de 470-500 nm passe-bande ou un filtre accordable d’émission.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole permettant la culture organotypique décrite ici est une version modifiée de18 du protocole décrit par De Simoni et Yu (2006)5. Les changements les plus importants ont été décrites ci-dessous. Tampon Tris est ajouté au milieu de culture, ce qui améliore la survie des tranches en dehors de l’incubateur au cours de la transduction virale et la modification du milieu cellulaire. La procédure de stérilisation de confettis est également modifiée. Alors …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Linda Hildegard Bergersen et Magnar Bjørås pour accéder à la cellule de laboratoire et équipement, personnel Janelia biologie moléculaire ressource partagée pour la production de virus et de plasmide et Koen Vervaeke pour assistance avec mesures de puissance de laser. Ce travail a été financé par l’Association norvégienne de la santé, le Conseil norvégien de la recherche et de l’équipement de microscopie a été financée par Norbrain.
Materials
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| BD Microlance 19G | BD | 301500 | Needles used for in- and outlet of bath |
| Bioxide gas | AGA | 105701 | |
| Brand pipette bulbs | Sigma-Aldrich | Z615927 | Pipette bulbs |
| Bunsen burner (Liquid propane burner) | VWR | 89038-530 | |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | 64-0106 | Temperature controller – thermometer part |
| CaCl2 | Fluka | 21100 | |
| CO2 | AGA | 100309 | CO2 for incubator |
| Cover glass, square Corning | Thermo Fischer Scientific | 13206778 | To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly. |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Delicate forceps | Finescience | 11063-07 | For dissection |
| Diamond scriber pen | Ted Pella Inc. | 54463 | |
| Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm | VWR | 612-1702 | Glass pipettes |
| Double edge stainless steel razor blade | Electron Microscopy Sciences | #7200 | Razor blade for vibratome |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco-Invitrogen | 24010-043 | |
| Filter paper circles | Schleicher & Schuell | 300,220 | Filter paper used for filtration of PFA |
| Fun tack | Loctite | 1270884 | Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath |
| Hand towel C-Fold 2 | Katrin | 344388 | |
| Harp, Flat for RC-41 Chamber, | Warner Instruments | 64-1418 | Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15 |
| HEPES, FW: 260.3 | Sigma | H-7006 | |
| Holten LaminAir, Model 1.2 | Heto-Holten | 96004000M | Laminar flow hood |
| Horse serum, heat inactivated | Gibco-Invitrogen | 26050-088 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| LCR Membrane, PTFE, | Millipore | FHLC0130 | Confetti |
| Leica VT1200 | Leica | 14048142065 | Vibratome |
| MEM-Glutamax with HEPES | Thermo Fischer Scientific | 42360024 | |
| MgCl2 | R.P. Normapur | 25 108.295 | |
| Micro Spoon Heyman Type B | Electron Microscopy Sciences | 62411-B | Small, rounded spatula with sharpened end for dissection |
| Millex-GP filter unit | Millipore | SLGPM33RA | Syringe filter unit |
| Millicell cell culture insert, 30 mm | Millipore | PICM03050 | Cell culture inserts |
| Minipuls 3 Speed Control Module | GILSON | F155001 | Peristaltic pump for live imaging – Control module part (connect to two-cannel head) |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nunclon Delta Surface | Thermo Fischer Scientific | 140675 | Culture plate |
| Nystatin Suspension | Sigma-Aldrich | N1638 | |
| Objective W "Plan-Apochromat" 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR |
| Parafilm | VWR | 291-1211 | |
| Paraformaldehyde, granular | Electron Microscopy Sciences | #19208 | |
| PC-R perfusion chamber | SiSkiYou | 15280000E | Bath for live imaging |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15070-063 | |
| Petri dish 140 mm | Heger | 1075 | Large Petri dish |
| Petri dish 92×16 mm | Sarstedt | 82.1473 | Medium Petri dish |
| Petridish 55×14,2 mm | VWR | 391-0868 | Small Petri dish |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | PBS tablets |
| R2 Two Channel Head | GILSON | F117800 | Peristaltic pump for live imaging – Two channel head part (requires control module) |
| Round/Flat Spatulas, Stainless Steel | VWR | 82027-528 | Large spatula for dissection |
| Sand paper | VWR | MMMA63119 | Optional, for smoothing broken glass pipettes |
| Scissors, 17,5 cm | Finescience | 14130-17 | Large scissors for dissection |
| Scissors, 8,5 | Finescience | 14084-08 | Small, sharp scissors for dissection |
| Single edge, gem blade | Electron Microscopy Sciences | #71972 | Single edge razor blade |
| Single inline solution heater SH-27B | Warner Instruments | 64-0102 | Temperature controller – heater part |
| Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm | Millipore | SCGPT05RE | Filter to sterilize solutions |
| Super glue precision | Loctite | 1577386 | |
| Surgical scalpel blade no. 22 | Swann Morton Ltd. | 209 | Rounded scalpel blade |
| Temperature controller TC324B | Warner Instruments | 64-0100 | Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly) |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253 | |
| Water jacketed incubator series II | Forma Scientific | 78653-2882 | Incubator |
Referenzen
- Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo. Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).
- Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes. J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).
- Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- De Simoni, A., Yu, L. M. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method. Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).
- Lim, H., et al. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).
- Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination. J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nat. Med. 20, 443-449 (2014).
- Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. Recombinant adeno-associated viral vector production and purification. Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).
- Kunkel, T. A. Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection. Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).
- Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression. J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).
- Rinholm, J. E., et al. Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths. Glia. 64, 810-825 (2016).
- Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons. J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).
- Jackson, J. G., O’Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).
- Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61, 541-555 (2009).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).
- Rinholm, J. E., et al. Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate. J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).
- Davison, A. N., Dobbing, J. Myelination as a vulnerable period in brain development. Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurowissenschaften. 305, 86-98 (2015).
- Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures. Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Pignataro, D., et al. Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System. Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).
- Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector. Gene Ther. 19, 49-60 (2012).
- Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis. J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).
