麻痺、視神経脊髄炎自己抗原アクアポリン 4 の T 細胞特定のマウスの視覚系障害の誘導

カリフォルニア大学、サンフランシスコ機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された実験的ガイドラインに準拠してすべての動物の手続きを行った。生後 8 週に購入された C57BL/6 (H-2 b) 雌マウスと C57BL/6 AQP4 -/- マウスは、A. Verkman によって提供されたします。 1 マウス接種 AQP4 ペプチド 準備完了フロイント ' s アジュバント (CFA) 在庫。。 結核 (菌 H37Ra) 乳鉢と乳棒を使用しての乾燥調製を細かく挽く。 追加地面に不完全フロイントアジュ菌 H37Ra ' 4 mg/mL の最終的な集中する s の補助。CFA を最大 6 ヶ月の 4 ° C で保存できます。 ディゾルブ (Ag) を最終濃度 1 mg/mL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で AQP4 ペプチドを凍結乾燥します。4 ° c または氷を維持 CFA/ペプチド エマルションを含む、活栓で結合されている 2 のルアーロック シリンジのアセンブリを準備します。 アタッチ プランジャー 2 男性ルアーロック接続とナイロン三方活栓なしガラスのルアーロック注射器。注射器に向かってレバーを切り替え、活栓を閉じる。テスト チューブとして使用する注射器が可能シリンジのオープン エンドを配置します。チューブ ラック加えられた安定性のためにこれを配置します。 渦 CFA 作業用ストックと Ag のソリューション。ペプチドの 1:1 ボリュームを追加/オープンのシリンジに CFA。CFA/Ag (50 μ L × 4) を 200 μ l 添加はマウスごとに必要です 。 注: 通常、準備の約 1 mL は、予防接種の利用量を減らす活栓で失われます。したがって、必要な容量の計算にこれを組み込むことが重要です 。 例: 5 マウスの免疫の: (200 μ L/動物 x 5 動物) + 1 mL 余分なボリューム = 2 mL 合計 CFA/Ag 必要があります。 注射器に、場所にそれを保持している間ガラス プランジャーを挿入し、活栓が上向き、注射器を反転します。未使用のメスの接続にコック レバーを切り替えます。慎重にシリンジから空気を除去するためにガラスのプランジャーに圧力を適用します。液体を塗りつぶします、活栓の 2 番目の男性のルアーロック接続します。 は、活栓の 2 番目の男性のルアーロック接続に 2 番目ガラス製注射器 (ピストンが完全に挿入される) を接続します。これはできるだけ少し余分な空気として含む活栓で接続されている 2 ガラス注射器のクローズド システムをする必要があります。 エマルジョンを作成する 、低温約 2 分約 10 分間氷の上の注射器を繰り返す寒さの 2 注射器間交互に液体を渡すプランジャーを押すと準備の粘度の明確な変化があるまで混合ミックスします。、非常に硬い、ホワイト エマルジョンの結果します。4 ° C でエマルジョンを含む注射器を冷蔵または、氷の維持 乳剤のすべてを 1 つのガラス ルアーロック注射器に転送、削除空のガラス製注射器および注射用 1 mL ルアーロック注射器交換します。エマルションを用いた新しい注射器を埋める、活栓からそれを削除し、針 (25 x 5/8) を添付します。 " 水テスト " 一貫性のエマルジョン。小さな皿に水の滴のエマルジョンを追放します。乳剤が分散されず、注射に適したがあることを示す. エマルジョンの分散する場合、は、注射の準備はありません; 転送液体ガラスに注射器や混合し、エマルジョンが硬いになるまで再びリラックスし続けます。 適切な一貫性を達成するまでに乳剤を再度テストします。 ドナー AQP4 -/- マウスの皮下注入 (サウスカロライナ) AQP4 ペプチドを含有エマルションを用いた。それぞれのマウスは、4 x 50 μ L 皮下注射 (200 μ 合計 (100 μ g ペプチド)) を受け取ります。4 サイト、下腹部の両側鼠径リンパ節 (LN) に流出して腋窩のレーンに流出する各脇の内側の箱壁の両側の両方を含める養子の転送受信者マウスあたり 1-2 免疫ドナー マウスが必要になります。 2。T 細胞培養と炎症性 T 細胞の分極 10-12 日、予防接種後は、マウスから LN を集める。 製氷皿で 60 mm ペトリ皿セル ストレーナー (メッシュ サイズ 70 μ m)、10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) 冷蔵 RPMI メディアと 100 U/mL ペニシリン 100 μ g/mL ストレプトマイシン (ペン-連鎖球菌) (RFP) を含むを準備します。 CO 2、続いて頚部転位への露出によって安楽死マウス。70% エタノールでマウスを浸すし、郭清の掲示板に各足蹠をピンします。 は、各脚の上下、首に脚の付け根から正中皮膚切開をカットしました。腹膜から皮膚を引っ張ったりし、緊張してボードにピン留めします。鼠径部や腋窩の LN を解剖し、氷の上、見積もり依頼を含むペトリ皿に配置します。 19 養子転送実験のため同じ予防接種グループ内のすべての動物から LN を組み合わせます。個々 の動物を Vβ 利用の流れフローサイトメトリー解析分離 LN。 RFP を含む 50 mL 遠心管に LN を含むセル ストレーナーを配置。細胞の回復を促進するのに RFP の 20-30 mL で洗浄、こし器を通して LN セルを押して滅菌 5 mL シリンジのプランジャーの平らな終わりを使用します。LN 細胞文化の時間まで処理全体で氷の上を維持します。 洗浄 2 回、5 分 393 × g で遠心分離します。第二その後、T 細胞のメディア (TCM) LN 細胞を再懸濁します。TCM に RPMI が含まれています 10% 熱-不活化 FBS、292 μ G/ml L-グルタミン、110 μ g/mL ピルビン酸ナトリウム、および 55 μ M 2-メルカプトエタノール、ペン連鎖球菌。通常、ドナー マウスあたり 5 mL TCM のボリュームが使用されます。 は、LN のセルをカウントします。予想収量は約 3-6 免疫マウス ドナーごとの 10 の 7 LN セル x です。脇に 3-4 x 10 拡散の試金のための 6 (以下のセクション 3 を参照してください). 養子転送 (セクション 6) 文化を偏光を設定。 10 μ g/ml の Ag、20 ng/mL 遺伝子組換えマウス インターロイキン (IL)-23 mL あたり 6 LN セル 5 x 10 の th17 細胞の偏光文化を準備し、10 ng/mL 組換えマウスを TCM に IL 6. また、5 x 10 の文化 10 μ g/ml の Ag mL あたり 6 LN 細胞を準備 Th1 偏波用と 10 ng/mL 組換えマウスを TCM に IL 12。 は、12 ウェル プレートに偏光の文化の混合物の井戸あたり 2 mL (1 x 10 の 7 セル) を追加します。2-4 ドナー マウスから LN 細胞 1 つ 12 ウェル プレートいっぱいになります。72 h の 5% CO 2 と 37 ° C で加湿のインキュベーターで培養を維持 は視覚的に 48 時間の活性化のための文化の LN セルを確認し、72 h 活性細胞は大規模なクラスターを形成、T 細胞より多形性になること、サイズが大きくなります。代謝の増加は、桃からオレンジに変更、メディアで pH の低下原因となります。残り 24 時間で細胞への毒性を防ぐために新鮮な TCM の 1 mL を追加し pH が十分に低いメディアを黄色にする場合、 養子転送のセクション 6 に進みます。Descr として細胞内サイトカイン染色 (ICS) によって偏光効率を検証可能性があります。セクション 5 で ibed です。 表面の Vβ 式 (セクション 4) のフローサイトメトリーによる解析のための個々 のマウスから LN を使用するカルチャを設定します。 5 × 10 6 10 μ g/ml の TCM の Ag mL あたり LN セルを準備します。 は、12 ウェル プレートによくあたり文化の 2 mL (1 x 10 の 7 セル) を追加します。文化は、10 日の 5% CO 2 と 37 ° C で加湿のインキュベーターで維持しなければなりません。セクション 4 に進みます。 3。拡散の試金 注: これはセクション 2.4 から続行されます。 TCM の mL あたり 6 セル 2 × 10 で、チューブの LN セルの 3-4 mL を準備します。 優しく数回、チューブの反転によってセルをミックスし、滅菌トラフに転送します。 96 ウェルのラウンドに使用細胞/ウェルのプレート 100 μ L にマルチ チャンネル pipettor 下部組織培養プレート。通常、4 Ag 濃度と Ag 参照なしの帳票をテストするための 15 の井戸をプレートします。 は、様々 な濃度で TCM、通常 80、20、5、1、0 μ g/ミリリットル (2 x 株) の Ag を希釈します。最終濃度 40、10、2.5、3 通の各濃度 100 μ L を追加します。0.5 と 0 μ g/mL。37 で約 72 時間インキュベート ° C 注: 手順 3.7 から 3.5 に放射性物質が含まれています。適切な使用方法、監視及び放射性物質の廃棄は、機関および政府の規制に従って実施する必要があります。 3 H-チミジンの作業の原液を準備 (40 µCi/mL) 25 mL RPMI に 1 mCi 3 H-チミジンを加えると 4 でこれを保管 ° C. ピペット滅菌トラフに作業溶液 0.5 mL。 3 H-チミジンの追加 25 μ L (1 µCi) あたりもマルチ チャンネル ピペットで移しなさい。さらに 18 時間 37 分間インキュベート ° C は 96 ウェルの細胞収穫機を使用ガラス フィルター マットの上に細胞を収穫し、70% エタノールでリンスします。乾燥後、フィルター マットを 5 mL シンチレーション液体でプラスチック製のサンプル袋にシールします。まあシンチレーション カウンターを使用して各メジャー放射能。 4。細胞表面の TCR Vβ 発現のフローサイトメトリー分析 注: これはセクション 2.6 から続行されます。抗体マウス TCR Vβ 2、3、4、5.1、5.2、6、7、8.1、8.2、8.3、9、10 b、11、12、13、14、17 a、商業的 TCR Vβ 式をテストできる。 TCR Vβ の検出、数回ピペッティングによる T 細胞培養プレートを取り除くし、管にセルを転送します。 2 s があり、0.1% アジ化ナトリウムと 2 mM PBS で EDTA を含む FACS バッファー (FB) で洗うです。 1 x 10 5 3 x 10 の密度で V 下 96年ウェル プレートに転送細胞/ウェル 6 セルです。セルを複数井戸 (Vβ テスト中につき 1 つの井戸) に分散する必要があります Vβ パネル全体がテストされている場合。 は、壊死細胞によって公開されている無料のアミンと反応する LIVE/デッド性染料で染色、フローサイトメトリーによる解析から死んだ細胞を除外します。製造元に従う ' 遠心分離、再懸濁性染料のための指示。ステイニングが細胞全体の 10-20 分の氷の上を孵化させなさい、光から細胞を守る、氷の維持 インキュベーション後、FB で一度プレートを洗います。TCR Vβ を検出するため FB の CD4 抗体の 1: 100 希釈を含むの 100 μ L のセルを中断 (RM4 5 クローン) と TCR Vβ。氷 15 60 分間インキュベート は FB で一度プレートを洗う、PBS で希釈した 4% パラホルムアルデヒドの 200 μ L を追加することでセルを修正します。氷の上に 20 分間インキュベートします。FB でプレートを洗浄し、フローサイトメトリーで分析します。 5。サイトカイン産生細胞のフローサイトメトリー 細胞内サイトカイン染色 (ICS) のタンパク質輸送阻害剤試薬 (例えば、GolgiPlug) の縮尺希釈で T 細胞培養で扱う TCM、防ぐために IC の前に 4 hサイトカイン分泌。その時、蛋白質の生産を引き起こすために 50 ng/mL ホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート (PMA) と 500 ng/mL イオノマイシン T 細胞をアクティブにします。 37 ° C で文化の 4 h 後上下、ピペッティングにより細胞培養プレートを取り除くし、遠心分離機管 (15 または 50 mL) に転送します。 FB を洗ってください。FB で 5 × 10 5 ウェルあたり 3 x 10 の 6 セルの密度で V 下 96年ウェル プレートに転送細胞を再懸濁します。 染色細胞生存率染付 (セクション 4.2) 前述のよう。、孵化後 FB で一度プレートを洗うです。 表面マーカーの検出のための抗体を次のように追加: 表面マーカーの検出、CD4 の抗体の 1: 100 希釈を含む FB の 100 μ L のセルを中断 (RM4 5 クローン). はオプションで、b220 抗体を含める (30-F11 のクローン) と CD11b (M1/70 のクローン) B 細胞と単球/マクロファージ、それぞれゲートを改善するために 1: 100 希釈で。一般的に、PE Cy7 抗 cd4 抗体、FITC アンチ B220、PerCP Cy5.5 抗 CD11b はよく働きます。抗体/螢光色素複合体の選択は、分析に使用される流れの cytometer の構成によって導かれる必要があり、抗体の至適濃度は経験的に決定する必要があります。 氷 15 60 分インキュベート FB を洗浄して氷の上に 20 分間固定/透過ソリューションを 200 μ l 添加の細胞を再懸濁します。これはセルを修正し、膜を permeabilize。 細胞内染色中に細胞膜の透過を維持するために は、FB ではなくパーマ/洗浄バッファー (PW) (希釈 1:10 10 の X の在庫から) を使用します。PW の 200 μ L の洗浄です。 ICS の準備 1: 100 希釈抗体のインターフェロン (IFN)-γ IL 17A 1 を使用して、x PW。1 つのオプションは、APC アンチ-IFN-γ (クローン XMG1.2) と PE アンチ-イル-17A (クローン eBio17B7) よく働く。細胞抗体カクテルの 100 μ L の細胞を再懸濁し、少なくとも 15 分間インキュベートします。それはまた 4 で一晩染色を続行することが可能 ° C PW を 200 μ l 添加の井戸とフローサイトメトリー用 FB 濁洗う。 並行して、無染色のサンプル (FB 抗体なしセル) を準備する検出器電圧とそれぞれの個々 の螢光色素は (すなわち、細胞または 1 つだけ抗体/螢光色素で染色補正ビーズ) の単染色サンプルを最適化補償スピル オーバー値を決定します。 流れの cytometer を使用、≥ 10,000 のセル (イベント)、実行可能な (LIVE/死者-負) CD4 のゲート + 細胞。T 細胞の正確なゲートを確保するため、除外、B220 + と CD11b + 細胞 (B 細胞と単球/マクロファージ、それぞれ)。CD4 内 + T 細胞の亜集団、IFN-γ (Th1 系統) または IL-17A (th17 細胞系統) を発現する細胞の比率を入力します。 6。養子の転送の病原性 AQP4 特異的 T 細胞 注: このステップ セクション 2.5 から続くよう: T 細胞文化および炎症性 T 細胞の分極。 回復を上下にずらす、ピペッティングして 50 mL のチューブに移し 12 ウェルのプレートからセルの偏光。Maintain 注射まで氷の上。 はセルをカウント、冷 PBS で 2 回洗浄し、PBS で 1 × 10 8 セル/mL の懸濁液を準備します。一般的に、時間内でセルを挿入します。 は軽く旋回でセルを混合し、射出時に 1 mL の注射器に転送。静脈内のセル (2 x 10 7) 200 μ L を管理 (静注) 各マウスは、尾静脈。 注入 200 では各受信者のマウスに i の. p. その日の 2 日後、百日咳 毒素の ng が 200 μ L の PBS で希釈しました。臨床疾患の兆候を毎日マウスを監視します。 7。臨床評価の ATCA 確認受信者マウス中枢神経系の自己免疫疾患の臨床症状の毎日。一般的にマウスが AQP4 特異的 T 細胞の養子転送後 5-8 日中枢神経系の自己免疫疾患の徴候を表示します。マウス神経機能障害の臨床症状が表示されます。マウスの通常の能力を定義する単純なマウスの評価を実行すると便利です。 テールの損失を評価マウス トーン。尾の基部に軽くマウスを保持、まっすぐ持ち上げます。継続的に尾の損失として記述されている、ドループ尾トーン (1 のスコア)。尾音の損失は、しばしば臨床病気の最初の兆候です。 平らな面に背中にマウスを置くことによって を正すためテスト反射。体幹失調の印である遅い立ち直り (2 得点)。素朴なマウスが完全に障害として権利能力の任意の遅さを獲得するので、背中にそれを配置しように抵抗します。この反射の 3-4 倍のマウスをテストする方が一般的です。 評価姿勢と歩行。低下の結果または歩行中に腰のドラッグの姿勢で変化を示すマウスを開始 (2.5 のスコア)。さらに病気の結果 1 つハインドの完全麻痺、単麻痺の上肢 (3.0 のスコア)、麻痺、両後肢の完全麻痺上肢 (3.5 のスコア)。前方の非常にゆっくりした動きに適度な quadraparesis、すべての四肢の脱力結果 (4 のスコア)。深刻な quadraparesis は前方移動できますほとんどない (4.5 のスコア)。最後に、重症な瀕死になるかは死ぬ (5 得点). 管理使用流体補充できなくなる代わりに、流体や固体の食品 1 mL の生理食塩水の i. p. の 5% ブドウ糖を取得するマウスにゲルの脱水と絶食に対抗するカップ、高カロリーのゲルとベーコン softies。瀕死の状態のマウスを安楽死させる。 8。ティッシュの準備学 100 mg/kg のケタミン 10 mg/kg キシラジンとマウスを麻酔し、郭清の掲示板に各足蹠をピンします。 オープン、胸を心を公開します。血液流出を許可する肝臓を切開します。蝶針を PBS と 10% ホルマリンの別のため池を利用した miniflow の可変的な速度ポンプのチューブに取り付けます。心臓の左心室に針を挿入し、5 ml の PBS、10% ホルマリンの 25 の mL に続いての灌流します。 頭し目を削除します。プロセスの目と網膜 20 を前述のよう。目のソケットを横切って、はさみを鼻に挿入、両側後方前方頭蓋骨をカットします。 頭蓋骨を削除、公開視神経、視交叉をカット、カセット 2 の泡パッドの間に配置します。 70% のエタノールに転送しますと、50% エタノール (24 h) (24 h)、10% ホルマリンに浸します。 脳と脊柱を取り外し、10% ホルマリンで配置。コロナの平面の連続セクション脳矢状のセクション脊髄コード (約半分) およびシリアル冠状面 (マウスあたり約 20 断面). パラフィン包埋を日常的にプロセス CNS サンプル。ヘマトキシリンとエオシン (視神経) またはルクソール高速青ヘマトキシリンとエオシン (脳と脊髄) の 8 μ m 厚いセクションを染色します。 神経と周囲髄膜 (視神経炎) の内でまたは主に (光 perineuritis) の周辺の髄膜に炎症が存在する視神経を評価します。 髄膜と実質炎症巣をカウント (> 10 クラスター化された単核細胞) 各マウスの脳・脊髄組織サンプルで。 9。生体内で網膜光干渉断層計 (OCT) によるイメージング 注: 一貫性のある眼を達成するために業務用機器 (例えば TruTrack 目の追跡者と Spectralis) を使用してマウスのスペクトル領域 OCT 網膜イメージングを実行方向運動の成果物を減らすと。 画像、前に 5 分は 1% トロピカミド (目ごとに 1 つのドロップ) と生徒を拡張し、2 リットル分 (1.5% イソフルラン) の安定した流れを提供する麻酔誘導室でイメージを作成するのには、マウスを配置します。熱マットをオンにし、麻酔後回復ケージを準備します。 イメージングのシリンダー上にマウスを置くし、それに応じて麻酔フローのリダイレクトします。0.3% ヒドロキシプロピルメチル セルロース、目の潤いを保つと、屈折の継続性を確保するために目を保護します。カスタム コンタクト レンズを検討する目に配置します。 赤外線眼底画像による誘導は、梁、視神経乳頭を中心に確保する、目にレーザーを直接します。垂直方向と水平方向の OCT スキャンは、網膜レーザーに垂直を産むことを確認してください。 高分解能モードで 30 からラスタライズを行う 25 B-スキャン、スキャンの平均です。 両方の目をイメージング後コンタクト レンズを削除し、ゲル状目薬を適用します。暖かい回復ケージ内マウスを残しています。 10。10 月の処理と解析 イメージング自動セグメンテーションのためのソフトウェア モジュールを使用します。 手動で正しいセグメント内側の膜 (ILM) と内側の網状層 (IPL) の制限に対応する、(IRL) 21 層の内部の網膜の限界を表すします。 網膜神経線維層 (視神経) と神経節細胞層 (GCL) IRL の限界内に存在し、重複しないことを確認します。 IRL の計算厚さ 1、2、および視神経乳頭とスプレッドシート ファイルへの輸出を中心に 3 mm の直径を持つ初期治療糖尿病性網膜症研究 (ETDRS) 2 グリッドを使用します。ソフトウェアは、各グリッドのセクターを平均することによってそれぞれの網膜の層の厚さを計算します。このため、視神経乳頭に対応する中央のセグメントを除外します。 は、各時点でグループ間の統計的な差異を分析します。一般化推定方程式を用いた交換相関行列と相関関係間目内部 21 の調整を使用して、それぞれのマウスの両方の目を分析します。