Ett protokoll för att korrekt identifiera och analysera synapserna i hippocampus skivor med hjälp av immunofluorescens beskrivs i denna artikel.
Synapser är specialiserade korsningar mellan nervceller, fastställande av styrka och spridningen av nervcellernas signalering i hjärnan. Antalet synapser är hårt reglerad under utveckling och nervcellernas mognad. Ännu viktigare, kan underskott i synapsen nummer leda till kognitiv dysfunktion. Utvärdering av synaps nummer därför en integrerad del av neurobiologi. Synapser är små och mycket kompakta i intakt hjärnan, är dock bedömningen av absoluta antalet utmanande. Det här protokollet beskriver en metod för att enkelt identifiera och utvärdera synapser i hippocampus gnagare skivor med hjälp av immunofluorescens mikroskopi. Den innehåller en trestegsprocess för att utvärdera synapser i hög kvalitet konfokalmikroskopi bilder genom att analysera samtidig localizationen av pre- och postsynaptiska proteiner i hippocampus skivor. Det förklarar också hur analysen utförs och ger representativa exempel från både retande och hämmande synapser. Detta protokoll ger en solid grund för analys av synapser och kan tillämpas på någon forskning som undersöker struktur och funktion av hjärnan.
Den mänskliga hjärnan består av ungefär 1014 synapser. Synaps nummer är hårt reglerad under utvecklingen och mognaden av det centrala nervsystemet (CNS). Hela utveckling, synaps nummer moduleras av synaptogenes och beskärning bildar funktionella neuronala nätverk. Inlärning och minne stöds av regleringen av synaps nummer och styrka, en process som kallas synaptisk potentiering och depression1. Viktigt, är stabiliseringen av mogen synapser väsentliga för att upprätthålla neuronala nätverksanslutningar. Underskott i synapsen densitet har dessutom rapporterats på de tidiga stadierna av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD)2. Därför är förmågan att korrekt identifiera och utvärdera synaps nummer grundläggande för bedömningen av hjärnans fysiologi och patologi.
Den extrema densitet och kompakta karaktär av synapser gör det utmanande för att uppskatta deras exakt antal i intakt hjärnområden. Kemiska synapser i CNS är gjorda av två nervceller i nära apposition, åtskilda av en synaptisk kluven3. Den pre synaptic terminal, eller synaptic bouton, framträder från ett axon och består av ackumulerade blåsor, som innehåller signalsubstanser som definierar en synaps specificitet — nämligen glutamat och gamma – aminosmörsyra (GABA) för retande och hämmande synapser, respektive. Membranen i blåsor innehåller vesikulär transportörer specifika för varje signalsubstans: vesikulära glutamat transportör (vGlut) för glutamat och vesikulär GABA transportör (vGAT) för GABA. Efter synaptic terminalen är en mycket tät struktur som består av flera proteiner, inklusive receptorer, adhesionsmolekyler och byggnadsställning proteiner. I retande synapser är efter synaptisk densitet-95 protein (PSD-95) den vanligast förekommande byggnadsställning protein4, modulerande excitatoriska N-methyl-D-aspartate(NMDA-) och α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA-) receptor funktion, medan gephyrin ankare hämmande receptorer till hämmande efter synaptic terminal5. Totalt, specificiteten av proteiner till pre- och post synaptic fack stöd i differentiering och identifiering av synaps undertyper.
Utvärdering av synaps nummer kan utföras med olika tekniker. Det vanligaste är användningen av elektronmikroskopi (EM), som möjliggör analys av synapsen i kompakt och intakt hjärnområden med hög förstoring och upplösning. Men denna teknik är mycket dyrt, kräver komplicerade provberedning och är mycket tidskrävande. Andra metoder inkluderar användning av array tomografi6, som har en stor nackdel eftersom det kräver specialiserade och dyra utrustning att utföra analysen. Dessutom transgena linjerna uttrycker specifika synaptic markörer är användbara utvärdera synaps nummer7, generering av nya linjer kan vara restriktiva och dyrt men överuttryck av proteiner kan resultera i oönskade off-target fenotyper.
På grund av dessa begränsningar och för enkelhet utvärdera många forskare synaps nummer genom att undersöka totalt synaptic proteinnivåer. Synaps förlust kan dock observeras före betydande förändringar i protein, som strukturella synaptic remodeling resultat i utspridningen av före eller efter synaptic apposition, med ingen nedbrytning av synaptic proteiner. Vidare i annons är synaptic proteinnivåer reducerad följande synaps degeneration eller neuronala dödsfall8,9. Kvantifiering av totala nivåer aktiverar inte denna åtskillnad. Således finns det ett behov av att utveckla en tillförlitlig, tillgänglig och korrekt metod för utvärdering av synaps nummer i hjärnan.
I den här artikeln beskrivs hur man noggrant identifiera och fastställa antalet synapser med hjälp av immunofluorescens mikroskopi i hippocampus gnagare hjärnan skivor. Synapserna definieras av colocalization av pre- och post synaptic markörer som visas i en punktuell fördelningen. Vi visar giltigheten av denna teknik genom studier av Wnt-signalering i hjärnan. WNTS är utsöndras proteiner viktiga för bildandet, eliminering och underhåll av synapser. I vivo induktion av en utsöndrade antagonist i Wnt kaskad, Dickkopf-1 (Dkk1), leder till excitatoriska synaptic förlust samtidigt hämmande synapser i hippocampus10. Vi illustrera identifiering och räkning av retande och hämmande synapser i hippocampus skivor från en vuxen mus som uttrycker Dkk1 och markera överförbarheten av denna teknik till andra typer av vävnadsodling/preparat.
En noggrann utvärdering av synaps nummer är viktigt inom neurovetenskap. Här visar vi hur man ska värdera tätheten av synapser i CA1 stratum radiatum regionen Hippocampus skivor som modellsystem. Betydelse med avseende på befintliga metoder demonstreras i vår senaste forskningartikeln som om effekten av Wnt-brist i hippocampus och där vi också utvärderat synaps nummer av singel-avsnitt EM10. Omfattningen av synaps förlust är liknande mellan singel-avsnitt EM och hjärnan-skiva metod beskrivs här10. Således visar detta konstaterande exaktheten och tillförlitligheten av tekniken.
Viktigt, är en begränsning av både singel-avsnitt EM och immunfärgning synapser, som presenteras här, oförmågan att exakt beräkna absoluta synaps numret för en specifik hjärnan region. Faktiskt, det är viktigt att identifiera eventuella globala morfologiska förändringar, eftersom förändringar i total volym kunde påverka synaptic nummer. En annan begränsning är att vissa antikroppar är mindre effektiva på färgning intakt hjärnregioner, delvis på grund av den extrema tätheten av synapsförbindelser. Vi upplevde högre kvalitet färgning av vGlut1 och gephyrin med denna skiva förberedelse och efterföljande PFA fixering för högst 1 h, jämfört med direkta upptagning av hela hjärnan i PFA (figur 2 c). Det senare ledde till klampade synaptic färgning, med hål i vävnaden. VGlut1 antikropp genomträngningen är dock fortfarande begränsad i båda metoderna (ett par av tiotals mikrometer). Vi övervinna inte denna begränsning, även med ökad antikropp inkubation, men ger antikropp penetration är större än det totala djupet som är avbildade, bör det finnas ingen påverkan på slutresultatet. Dessutom bör särskild försiktighet iakttas så att färgningen är även under hela förvärvade stacken.
I vår studie ville vi skilja excitatoriska från hämmande synapser. Följaktligen valde vi vGlut1/PSD-95 och vGAT/gephyrin, respektive, som dessa proteiner uttrycks mycket i vuxen mus hippocampus och är specifika för varje synaps subtyp4,5. Andra retande och hämmande synaptisk markörer kunde ha använts för att identifiera varje respektive synapsen, såsom receptorer berikad på varje synaps, inklusive NMDA- och AMPA-receptorer för retande och GABAA receptorer för hämmande synapser. Andra neurotransmittorer eller neuromodulators kan också identifieras med våra protokoll, och säkerställer att specifika antikroppar finns, som visas för dopaminerga synapser i striatum22. Dessutom kan att minska tjockleken på varje skiva till 120 µm delvis övervinna den låga mängden produktproverna med akut skivor, vilket är absolut nödvändigt för studier i lilla hjärnstrukturer såsom amygdala.
Framtida tillämpningar av våra protokoll kan genomföras i studien av olika hjärnområden och störningar. Till exempel i striatum (en region av hjärnan vid Parkinsons sjukdom), skulle en kombination av vGlut2/PSD-95 eller vGlut1/PSD-95 kunna användas för att skilja mellan de retande synapserna från afferenter kommer från cortex eller thalamus, respektive22.
Sammanfattningsvis har vi visat en tillförlitlig metod att undersöka antalet synapser i hjärnan vävnader med pre- och post synaptic markörer för att definiera en synaps. Kritiska steg inbegripa förberedelse av bra Hippocampus skivor, en fixering tid av upp till 1 h i PFA, tillämpningen av tillräckligt monteringsmedium, användning av tillförlitliga antikroppar, lämplig bild förvärv inställningar och stränga synaptic puncta upptäckt. Slutligen, denna metod är relativt snabbt och är enkelt reproducerbar av alla laboratorier som har tillgång till en confocal Mikroskop.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust och Parkinson UK. Vi vill också tacka Ms. Johanna Buchler för hennes bidrag av confocal bilder och medlemmarna i lab för deras konstruktiva synpunkter på manuskriptet och metodik.
Vibratome | Leica | VT1000S | |
Primary antibody | Millipore | AB5905 | vGlut1 (1:2000) |
Primary antibody | Thermo Scientific | MA1-046 | PSD-95 (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 131 004 | vGAT (1:500) |
Primary antibody | Synaptic Systems | 147011 | Gephyrin (1:500) |
Primary antibody | Abcam | ab5392 | MAP2 (1:10000) |
Secondary antibody | Jackson Laboratories | 706-545-148 | Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600) |
Secondary antibody | Abcam | ab175470 | Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600) |
Mounting medium | SouthernBiotech | 00-4958-02 | Fluoromount-G |
Confocal Microscope | Olympus | NA | FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%. |
Analysis software | PerkinElmer | NA | Volocity |
Scalpel | Swann-Morton | 203 | No 11 |
Super Glue | Loctite | 1446875 | |
95% O2, 5% CO2 | BOC | NA | Cylinder |
24-well plate | Corning | 3524 | |
Glass slides | Thermo | 7107 | 08-1.0mm thick |
Petri Dish | Corning | 430167 | |
iDkk1 mice | N/A | N/A | Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKIIα rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKIIα rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents for solutions: | |||
NaCl | Sigma | V800372 | |
KCl | Sigma | P9333 | |
Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
Ca2Cl | Sigma | 223506 | |
Mg2Cl | Sigma | M9272 | |
NaH2PO4 | Sigma | 71505 | |
Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
D-Glucose | Sigma | G5767 | |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Triton-X | Sigma | T8787 | |
Donkey Serum | Millipore | S30-100ml | |
PFA | Sigma | P6148 |