Vi beskriver bruk av laser fange microdissection hente prøver av ulike celle populasjoner fra forskjellige hjernen regioner genet og microRNA. Denne teknikken tillater studiet av differensial effekter for traumatisk hjerneskade i bestemte regioner av rotte hjernen.
Muligheten til å isolere bestemte hjernen regioner av interesse kan hindres i vev tilknytningene teknikker som ikke beholder deres geografiske fordeling. Slike teknikker skew også potensielt gene expression analyse fordi selve prosessen kan endre uttrykket mønstre i enkeltceller. Her beskriver vi en laser fange microdissection (LCM) metode for å selektivt samle spesifikke hjernens regionene påvirkes av traumatisk hjerneskade (TBI) ved hjelp av en modifisert Nissl (cresyl fiolett) flekker protokollen og veiledning av en rotte hjernen atlas. LCM gir tilgang til områder av hjernen i deres opprinnelige posisjoner og muligheten til å bruke anatomiske landemerker for identifikasjon av hver bestemt område. Dette har LCM vært brukt tidligere til å undersøke hjernen regionen bestemte byggkorn under TBI. Denne protokollen tillater undersøkelse av TBI-induserte endringer i genet og microRNA uttrykk i forskjellige hjernen områder innenfor samme dyret. Prinsippene for denne protokollen kan endres og brukes til en rekke studier som undersøker genomisk uttrykk i andre sykdom og/eller dyremodeller.
Pattedyr hjernen er utrolig komplekse og heterogene hundrevis til tusenvis av cellen typer1. Faktisk menneskelig studier har vist at i regioner som frontal cortex, strukturelle og funksjonelle forskjeller i hvit og grå materie gjenspeiles i distinkte og divergerende transcriptional profiler2. Hjernen heterogenitet har vært en stor utfordring å tolke genuttrykk data og innen hjerneskade. Denne tvetydighet i preklinisk studier har senere førte til hundrevis av mislykkede kliniske studier av behandlinger for hjernen skade3.
Vi bruker laser fange microdissection (LCM) metoder for å studere traumatisk hjerneskade (TBI)-indusert genet feilregulering i rotte hjernen4, med fokus på hippocampus, en hjerne region som er avgjørende for læring og hukommelse5. Laser fangst og analysere genuttrykk både døde og overlevende neurons gir oss en større forståelse av rollen stochasticity i genuttrykk for utfallet (neuronal overlevelse) etter TBI6. LCM teknikker har også vist seg nyttig for å utforske effekten av TBI på hippocampus neurons sammenlignet unge og aldring mus7 eller rotter8.
Nyere studier undersøkt vi andre områder av rotte hjernen negativt påvirket av TBI, med fokus på områder i rotter og menneskelige TBI pasienter som er tilknyttet executive funksjon (dvs. frontal cortex9) og TBI samtidige; disse samtidige inkluderer depresjon (i.e. nucleus accumbens10) og døgnrytmen (suprachiasmatic kjernen11). I tidligere studier, Huusko og Pitkanen12 og Drexel et al. 13 brukte LCM undersøke genuttrykk i thalamus og hypothalamus. Vår studie bygger på disse tidligere observasjoner og omfatter fire andre hjernen områder. For å studere regionspesifikke molekylær endringene indusert etter TBI, var det nødvendig å få kompetanse i å identifisere og få celletyper i disse områdene bruker en LCM system. UV-skjæring og infrarød (IR) laser tillater presis microdissection ønsket hjernen regioner. Her beskriver vi hvordan vi bruker dette LCM systemet, guidet av stereotaxic koordinater i den rotte hjernen atlas14, og laser fange fire rotte hjernen regioner som er ulikt påvirket av metoden eksperimentell væske-perkusjon hjernen skader 4.
Molekylære studier av pattedyr hjernen, har LCM blitt en viktig teknikk. Denne artikkelen viser at med kombinasjonen av de IR og UV kutte lasere i LCM systemet kan fange genomisk endringer i en region av pattedyr hjernen. Disse områdene omfatter de identifiserbar med konvensjonelle LCM-kompatible flekker, som cresyl fiolett eller hematoxylin og eosin. Hastigheten på laser-fangst prosessen og evne til å utføre LCM på tykkere 30 µm deler på pennen membran lysbilder kan ikke bare hente tilstrekkelige mengder av cellen prøver, men også å isolere RNA fra LCM prøver av egnet kvalitet for alle typer nedstrøms genomic analyse; Disse analysene er microarrays16, PCR matriser17og kvantitative sanntid PCR18.
Våre data gi en begrunnelse for studier som utnytter LCM vev. Vi finner at miR-15b upregulated i hippocampus og cortex (Figur 4) men downregulated i nucleus accumbens og kan være biologisk gjelder forståelsen av differensial virkningene av TBI i hjernen. En tidligere studie antydet at økninger i kortikale neuronal sikkerhetsproblemet for skade skyldes overuttrykte flere miRNAs som negativt regulerer Pro overlevelse gener, som Bcl-219. Målet skanning analyser viser Bcl-2 også regulert av miR-15b; dermed våre data tyder på en mekanistisk forklaring for hvorfor regioner av hjernen (dvs., FCx) kan være selektivt sårbare for TBI. Det er viktig å huske de fleste gener er regulert av flere miRNAs og samkjøre endringer i noen en miRNA til et bestemt mål gen er vanskelig. Videre indikerer disse dataene at visse endringer i genet og microRNA uttrykk kan brukes som biomarkers på regionspesifikke hjerneskade. Faktisk vi bruker disse dataene i studier av hvordan nye neuroprotective narkotika forbindelser med antidepressant egenskaper kan ulikt påvirke gene og microRNA uttrykk i områder av hjernen knyttet til nevropsykiatriske lidelser. En begrensning av vår undersøkelse er at under flere trinn av lysbildet forberedelse prosesser for LCM, RNA integritet kan bli kompromittert. Denne protokollen beskriver fremgangsmåten for å redusere risikoen for RNA degradering. En annen begrensning er relativt liten utvalgsstørrelsen brukt til statistisk beregning. I fremtiden bør studier, øke utvalgsstørrelsen redusere effektene av gene og miRNA uttrykk blant enkelte dyr.
Fordelen med LCM er realisert i translasjonsforskning genomisk studier med dyr modeller for menneskelig sykdom og sykt vev20,21,22,23. Uten evne til å fange bestemt celle populasjoner, ville transcriptional profiler av ulike hjernen regioner være en ukjent og økonomiregneark blanding av mange celletyper. Bruke LCM metoder i hjernen skade studier har ført til dagens innsats å avgrense hjernen regionen bestemte biomarkers og å forstå hvordan de samsvarer med sirkulerende biomarkers for TBI.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å erkjenne Elizabeth Sumner for hennes hjelp til å redigere dette manuskriptet. Finansiering for dette prosjektet mottok delvis av Moody Project for Traumatisk Brain skader translasjonsforskning og RO1NS052532 klart å etablere.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |