אנו מתארים את השימוש בלייזר microdissection לכידת להשיג דגימות של אוכלוסיות תאים נפרדים של אזורים שונים במוח עבור ג’ין וניתוח microRNA. טכניקה זו מאפשרת חקר ההשפעות דיפרנציאלית של פגיעה מוחית טראומטית באזורים ספציפיים של המוח חולדה.
להיות המניע את היכולת לבודד אזורים ספציפיים במוח עניין בטכניקות השיוך רקמות, אשר אינם שומרים על התפוצה המרחבית שלהם. טכניקות אלה להטות גם פוטנציאל הביטוי מפענוח כי התהליך עצמו יכול לשנות דפוסי ביטוי בתאים בודדים. כאן נתאר שיטת microdissection (LCM) לכידת לייזר לאסוף באופן סלקטיבי של אזורים ספציפיים במוח מושפע על ידי פגיעה מוחית טראומטית (TBI) באמצעות Nissl שונה (cresyl סגול) צביעת פרוטוקול והדרכה של אטלס מוח עכבר. LCM מספק גישה לאזורים במוח עמדותיהם יליד ויכולת להשתמש ציוני אנטומי עבור זיהוי של כל אזור מסוים. לשם כך, הפונקציה LCM שימש בעבר לבחון גנים ספציפיים במוח באזור ביטוי TBI. פרוטוקול זה מאפשר בחינת שינויים המושרה TBI בביטוי גנים ו- microRNA באזורי מוח שונים בתוך אותה חיה. העקרונות של פרוטוקול זה יכול להיות מתוקן, חלה על מגוון רחב של מחקרים גנומית ביטוי המחלה ו/או בבעלי חיים אחרים.
בתרבית של המוח הוא הטרוגנית עם מאות אלפי סוגי תאים1ומורכבת להפליא. ואכן, מחקרים בבני אדם הראו כי באזורים כגון בצמוד, מבניים, הבדלים תפקודיים בעניין לבן ואפור משתקפים באופן מובהק ופרופילי תעתיק מתבדרת2. הטרוגניות המוח היה מכשול גדול לפרש נתונים ביטוי גנים, בתחום של פגיעה מוחית. עמימות זו מחקרים פרה הוביל מאות ניסויים קליניים שנכשלו הטיפולים עבור פגיעה במוח3.
אנו משתמשים בלייזר לכידת microdissection (LCM) שיטות ללמוד פציעת מוח טראומטית (TBI)-induced ג’ין dysregulation עכברוש המוח4, התמקדות ההיפוקמפוס, אזור במוח חיונית למידה וזיכרון5. היכולת לייזר לכידת וניתוח ביטוי גנים גוסס והן ששרדו נוירונים נותן לנו הבנה טובה יותר של התפקיד של stochasticity בביטוי הגנים בקביעת התוצאה (הישרדות עצביים) לאחר TBI6. טכניקות LCM גם הוכיח שימושי עבור חקר ההשפעות של TBI על נוירונים בהיפוקמפוס כאשר משווים7 או חולדות עכברים צעירים ובטיפולים8.
במחקרים אחרונים, בדקנו את אזורים אחרים של המוח עכברוש מושפע לרעה TBI, עם דגש על תחומים בחולדות בני אדם חולים TBI המשויכות פונקציה המבצעת (קרי החזיתית9), מחלות רקע TBI; מחלות רקע אלה כוללות דיכאון (קרי גרעין האקומבנס10) הפרעות בשעון הביולוגי (גרעין suprachiasmatic11). מחקרים קודמים, Huusko ו- Pitkanen12 , דרקסל. et al. 13 שימוש LCM לבחון גנים תלמוס, ההיפותלמוס. המחקר שלנו מתבססת על תצפיות קודמים אלה, כולל ארבעה אזורים אחרים של המוח. ללמוד את השינויים מולקולרי ספציפי לאזור המושרה לאחר TBI, היה צורך להתמקצע זיהוי וקבלת סוגי תאים באזורים אלה באמצעות מערכת LCM. UV-חיתוך, אינפרא-אדום (IR) הלייזרים מאפשרים microdissection מדויק של אזורים במוח הרצוי. כאן, אנו מתארים איך נוכל להשתמש במערכת LCM, מונחה על ידי קואורדינטות stereotaxic העכברוש המוח אטלס14, כדי לזהות לייזר לכידת ארבעה עכברים המוח אזורים המושפעים באופן שונה בשיטת פציעה ניסיוני המוח נוזל-כלי הקשה 4.
ללימודים מולקולרית של המוח יונקים, הפונקציה LCM הפך טכניקה חיונית. מאמר זה מדגים כי באמצעות השילוב של לייזרים חיתוך IR ו UV במערכת LCM יכול ללכוד שינויים גנומית בכל אזור של המוח יונקים. אזורים אלה כוללים את אלה לזיהוי עם כתמי LCM תואמי קונבנציונליים, כגון cresyl, ויולט או hematoxylin ואאוזין. המהירות של תהליך לכידת לייזר ואת היכולת לבצע LCM להקשיה מיקרומטר 30 בשקופיות ממברנה עט מאפשר להשיג לא רק כמויות מספיקות של דגימות תאים, אלא גם כדי לבודד RNA מדגימות LCM באיכות מתאימה לכל סוגי במורד הזרם אנליזה גנומית; ניתוחים אלה כוללים מיקרו-מערכים16, PCR מערכים17כמותיים PCR בזמן אמת18.
הנתונים שלנו לספק תירוץ עבור מחקרים אשר מנצלים LCM רקמות. אנו מוצאים את מיר-15 ב upregulated היפוקמפוס, קליפת המוח (איור 4) אבל downregulated ב גרעין האקומבנס, וייתכן שהוא רלוונטי מבחינה ביולוגית להבנת תופעות דיפרנציאלית של TBI במוח. מחקר קודם הציע כי העלאות פגיעות העצבית בקליפת המוח לפגיעה כתוצאה ביטוי של מספר miRNAs שלילית המסדירים גנים פרו-הישרדות, כגון Bcl-219. יעד סריקה ניתוח מראה Bcl-2 גם מוסדר על ידי מיר-15; לפיכך, הנתונים שלנו מציע הסבר למה מכניסטית אזורים ספציפיים במוח (קרי, FCx) עלול להיות חשוף באופן סלקטיבי TBI. חשוב לזכור שרוב הגנים מוסדרים על ידי miRNAs מרובים מתאם לשינויים כל miRNA אחד כדי גן ביעד מסוים קשה. יתר על כן, נתונים אלה מציינים כי שינויים מסוימים בביטוי גנים ו- microRNA עשוי לשמש סמנים ביולוגיים של נזק מוחי ספציפי לאזור. אכן, אנחנו משתמש כעת נתונים אלה במחקרים של neuroprotective חדשים סמים תרכובות עם סגולות נוגדות דיכאון ישפיע באופן שונה ביטוי גנים ו- microRNA באזורים במוח המקושר מנוטלי הפרעות. מגבלה אחת של המחקר שלנו היא כי במהלך השלבים מרובים של תהליכי הכנה שקופיות עבור הפונקציה LCM, RNA עשוי להפוך הופר. פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הדרושים כדי לצמצם את הסיכון של RNA השפלה. מגבלה נוספת היא גודל המדגם קטן יחסית המשמש עבור החישוב הסטטיסטי. בעתיד מחקרים, הגדלת גודל המדגם צריך להפחית את ההשפעות של שינויים בביטוי הגנים, miRNA בין חיות בודדות.
היתרון של הפונקציה LCM הבינה translational גנומית מחקרים באמצעות מודלים חייתיים של מחלות אנושיות ו לרקמות החולות20,21,22,23. ללא היכולת ללכוד אוכלוסיות תאים מסוים, הפרופילים תעתיק של אזורי מוח שונים יהיה שילוב ידוע ו לפענוח של סוגי תאים רבים. בשיטות LCM במחקרים פגיעה במוח הובילה למאמצים הנוכחי על המוח באזור מסוים סמנים ביולוגיים, כדי להבין איך הם לתאם עם מחזורי סמנים ביולוגיים של TBI.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות אליזבת סאמנר עזרה עריכת כתב היד הזה. המימון לפרויקט זה סופק בחלקו על ידי מודי פרויקט עבור חקר המוח פציעה טראומטית Translational ו- RO1NS052532 כדי HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |