In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos
Summary
Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.
Abstract
As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento do MHC-tetrâmero de coloração de células T antígeno-específicas, analisadas por citometria de fluxo tem revolucionado a nossa capacidade de estudar e compreender o immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não é possível determinar a localização espacial de pilhas de T antígeno-específicas de outras células e estruturas em tecidos e técnicas atuais de desagregação para extrair o T células necessárias para citometria de fluxo têm limitado eficácia em tecidos não-linfoides. In situ MHC-tetrâmero coloração (IST) é uma técnica para visualizar as células T que são específicas para os antígenos de interesse em tecidos. Em combinação com imuno-histoquímica (IHC), IST pode determinar a abundância, localização e fenótipo das células CD8 e CD4 T de antígeno-específicas em tecidos. Aqui, descrevemos um protocolo para manchar e enumerar as células T CD8 de antígeno-específicas, com fenótipos específicos localizados dentro de compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são as mesmas que usamos em nossa recente publicação por Li et al, intitulado “células produtoras de Simian vírus da imunodeficiência em folículos são parcialmente suprimidos pelo CD8 células+ In Vivo.” Os métodos descritos são amplamente aplicáveis, porque pode ser usados para localizar, fenótipo e quantificar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicos para os quais tetrâmeros MHC estão disponíveis, em qualquer tecido.
Introduction
As células T são essenciais para muitos processos imunológicos, incluindo a detectar e eliminar as células infectadas por vírus, evitando a auto-imunidade, auxiliando na produção de células B e células plasmáticas de anticorpos e detectar e eliminar as células cancerosas. O desenvolvimento de peptídeo/MHC classe I tetrâmero coloração de antígeno-específicas1 as células T CD8 e o mais recente desenvolvimento de MHC classe II tetrâmero coloração de células T CD42 por citometria de fluxo revolucionou a nossa capacidade de estudar e compreender o Immunobiology de células T. Embora extremamente útil para a determinação da quantidade e do fenótipo das células de T antígeno-específicas, citometria de fluxo não permitir a detecção da localização espacial das pilhas de T antígeno-específicas para outras células e estruturas nos tecidos e atual técnicas de desagregação para extrair as células T necessários por citometria de fluxo tem limitada eficácia em tecidos não-linfoides3.
Nós e os outros têm desenvolvido métodos usando peptídeo carregado MHC-classe I e classe tetrâmero II ou multimer reagentes para manchar as células CD8 e CD4 T antígeno-específicas em tecidos4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST estes métodos permitem a determinação do local, abundância e fenótipo de células CD8 e CD4 T antígeno-específicos tecidos e fornecer um meio para detectar dessas células em relação a outras estruturas nos tecidos e células. Nosso grupo tem usado extensivamente MHC-eu tetrâmero coloração para estudar o vírus de imunodeficiência humana (HIV) – e o vírus da imunodeficiência símia (SIV) – células T CD8 específicas nos tecidos linfoides, genitais e retais para obter uma compreensão do HIV e SIV imunopatogênese e para identificar correlações de vacinação bem sucedida estratégias14,15,16,17. Além disso, também desenvolvemos uma técnica que combina o IST com hibridação in situ (ISH) para localizar e quantificar as células T CD8 de vírus específicos e células infectadas por vírus em tecidos e para determinar os níveis de efetor-alvo na vivo 18 , 19.
Aqui, descrevemos um protocolo utilizando peptídeo carregado MHC-eu tetrâmeros manchar as células T CD8 de antígeno-específicas em secções de tecido fresco, para tecidos de corante de contraste usando IHC e quantificar células com fenótipos específicos em compartimentos de tecido específico. Estes procedimentos são os mesmos que foram utilizados em nossa recente publicação por Li et al, em que determinamos a localização, abundância e fenótipo de células T específicas SIV em tecido linfoide durante a infecção crônica do SIV em macacos20.
Para este procedimento, tecidos frescos são seccionados e incubados durante a noite com MHC do peptide-carregado-eu tetrâmeros conjugados a moléculas de tiocianato de fluoresceína (FITC). Então, eles são fixos em paraformaldeído. Após a fixação do tecido, o sinal de tetrâmeros o MHC é amplificado usando anticorpos de coelho anti-FITC e incubadas com fluorescente etiquetados anticorpos IgG anticoelho que mais amplificam o sinal dos limite tetrâmeros. IHC é usado em conjunto com o IST para caracterizar as células T antígeno-específicas e células circundantes. Anticorpos que reconhecem epitopos na superfície das células ou no espaço extracelular são incluídos na incubação preliminar com os tetrâmeros. Anticorpos que reconhecem epítopos intracelulares exigem permeação da parede celular antes da coloração. As secções de tecido manchado são fotografadas usando um microscópio confocal e analisaram utilizando o software confocal. Pilhas etiquetadas são quantificadas utilizando microscopia confocal software ou ImageJ. O protocolo descrito pode ser usado para manchar essencialmente qualquer célula T CD8 antígeno-específicas em qualquer tecido para qual MHC-eu tetrâmeros estão disponíveis.
Protocol
Representative Results
Discussion
IST combinada com IHC fornece uma ferramenta essencial para detectar, caracterizar e quantificar as células T CD8 de antígeno-específicas em ambientes nativos com o contexto de outras células e estruturas do tecido. Aqui, descrevemos os procedimentos detalhados para IST combinada com IHC, seguido de análise quantitativa de imagem, para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T CD8 de antígeno-específicas em linfonodos de macacos rhesus. Coloração semelhante pode ser aplicada ao ser humano…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública concede a partir do National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol/gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
Referenzen
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