Summary

In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti

Published: September 22, 2017
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Summary

Qui, descriviamo un metodo che unisce in situ MHC-tetramero colorazione immunoistochimica per determinare la localizzazione, fenotipo e la quantità di cellule T antigene-specifiche nei tessuti. Questo protocollo viene utilizzato per determinare le caratteristiche spaziali e fenotipiche delle cellule CD8 T antigene-specifiche rispetto a strutture in tessuti e altro tipo di cellula.

Abstract

Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l’autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo di MHC-tetramero macchiatura delle cellule T antigene-specifiche analizzate tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere l’immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non può determinare la localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e le attuali tecniche di disaggregazione per estrarre le T cellule necessarie per citometria a flusso hanno un’efficacia limitata in tessuti non linfoidi. In situ MHC-tetramero macchiatura (IST) è una tecnica per visualizzare le cellule T che sono specifiche per gli antigeni di interesse nei tessuti. In combinazione con immunohistochemistry (IHC), IST può determinare l’abbondanza, la posizione e il fenotipo delle cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti. Qui, descriviamo un protocollo per macchiare ed enumerare le cellule CD8 T antigene-specifiche, con specifici fenotipi che si trova all’interno di compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse che abbiamo usato nella nostra recente pubblicazione da Li et al., intitolato “cellule producenti su Virus dell’immunodeficienza delle scimmie in follicoli sono parzialmente soppresso da CD8+ cellule In Vivo.” I metodi descritti sono ampiamente applicabili perché può essere utilizzati per localizzare, fenotipo e quantificare essenzialmente qualsiasi cella di CD8 T antigene-specifiche per cui i tetrameri MHC sono disponibili, in tutto il tessuto.

Introduction

Le cellule T sono fondamentali per molti processi immunologici, compreso rilevazione ed eliminando le cellule infettate da virus, impedendo l’autoimmunità, assistendo nella produzione delle cellule di B e delle cellule di plasma di anticorpi e rilevare ed eliminare le cellule tumorali. Lo sviluppo del peptide/MHC di classe I tetramero macchiatura di antigene-specifiche le cellule CD8 T1 e il più recente sviluppo di MHC classe II tetramero macchiatura delle cellule di T CD42 tramite flusso cytometry ha rivoluzionato la nostra capacità di studiare e comprendere la immunobiologia delle cellule T. Mentre estremamente utile per determinare la quantità e il fenotipo delle cellule T antigene-specifiche, citometria a flusso non consente la rilevazione della localizzazione spaziale delle cellule T antigene-specifiche ad altre cellule e strutture nei tessuti e corrente tecniche di disaggregazione per estrarre le cellule T necessari per citometria a flusso hanno limitato l’efficacia in tessuti non linfoidi3.

Noi ed altri abbiamo sviluppato metodi utilizzando peptide-caricato MHC di classe I e classe II tetramer o multimer reagenti per macchiare le cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche in tessuti4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST questi metodi consentono la determinazione della posizione, abbondanza e fenotipo di cellule CD8 e CD4 T antigene-specifiche nei tessuti e forniscono un mezzo per rilevare di queste celle relative altre cellule e strutture nei tessuti. Il nostro gruppo ha utilizzato estesamente MHC-ho tetramero macchiatura per studiare il virus di immunodeficenza umana (HIV) – e virus dell’immunodeficienza delle scimmie (SIV) – cellule di T di CD8 specifiche nei tessuti linfoidi, genitale e rettale per acquisire una comprensione di HIV e SIV immunopatogenesi e per identificare correlazioni di vaccinazione successo strategie14,15,16,17. Inoltre, abbiamo anche sviluppato una tecnica che combina IST con ibridazione in situ (ISH) di localizzare e quantificare le cellule T CD8 specifici virus e cellule infettate da virus nei tessuti e di determinare i livelli di effettore–obiettivo in vivo 18 , 19.

Qui, descriviamo un protocollo utilizzando peptide-caricato MHC-I tetrameri per macchiare le cellule CD8 T antigene-specifiche nelle sezioni di tessuto fresco, a tessuti controcolorazione con IHC e quantificare le cellule con fenotipi specifici nei compartimenti tissutali specifici. Queste procedure sono le stesse sono state usate nella nostra recente pubblicazione da Li et al., in cui abbiamo determinato la posizione, l’abbondanza e fenotipo delle cellule di T di SIV-specific in tessuto linfoide durante l’infezione cronica di SIV in macachi20.

Per questa procedura, tessuti freschi sono sezionate e incubate durante la notte con caricamento del peptide di MHC-I tetrameri coniugati a molecole di tiocianato di fluorescina (FITC). Quindi sono fissati in paraformaldeide. Dopo aver sistemato il tessuto, il segnale dai tetrameri MHC viene amplificato usando gli anticorpi di coniglio anti-FITC e incubate con anticorpi di IgG di anti-coniglio fluorescente contrassegnati, che amplificano ulteriormente il segnale dai tetrameri associati. IHC è utilizzato in combinazione con IST per caratterizzare le cellule T antigene-specifiche e le cellule circostanti. Gli anticorpi che riconoscono epitopi sulla superficie delle cellule o nello spazio extracellulare sono inclusi in incubazione primaria con i tetrameri. Gli anticorpi che riconoscono epitopi intracellulari richiedono permeazione della parete della cellula prima della colorazione. Le sezioni di tessuto macchiato sono Imaging utilizzando un microscopio confocale e analizzati utilizzando software confocale. Cellule con etichettate vengono quantificate utilizzando software di microscopia confocale o ImageJ. Il protocollo descritto può essere utilizzato a macchiare essenzialmente qualsiasi cellule CD8 T antigene-specifiche in qualsiasi tessuto per cui MHC-I tetrameri sono disponibili.

Protocol

1. giorno 1: taglio di tessuto fresco e incubazione primaria uso un bisturi per tagliare il tessuto fresco in pezzi piccoli (circa 0,5 cm di larghezza di 0,5 cm di altezza). Separatamente ogni tessuto per un pistone per colla e incorporarli con 3-5 mL dell’agarosi di basso-fusione di 4% in PBS. Etichettare il pistone con le informazioni di tessuto usando un adesivo. Metterlo in un supporto refrigerato in un secchio di ghiaccio per solidificare. Accendere il microtomo e impostare lo spessore delle sez…

Representative Results

Figura 1 Mostra come raccogliere immagini confocal utilizzando un microscopio confocale. Nella figura 2 viene illustrata l’analisi quantitativa immagine usando ImageJ. Figure 3 e 4 indicano rappresentante immagini dei tessuti di linfonodo da un SIV infettati macaco rhesus macchiato con tetrameri MHC, CD8 anticorpi e anticorpi CD20 e servono a dimostrare la specificità della MHC-tetramero coloraz…

Discussion

IST combinato con IHC fornisce uno strumento essenziale per rilevare, caratterizzare e quantificare le cellule CD8 T antigene-specifiche in ambienti nativi con il contesto di altre cellule e strutture del tessuto. Qui, abbiamo descritto le procedure dettagliate per IST combinato con IHC, seguita da analisi dell’immagine quantitativa, per determinare la posizione, l’abbondanza e fenotipo di cellule T CD8 antigene-specifiche nei linfonodi da macachi rhesus. Macchiatura simile può essere applicata all’essere umano, del mou…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede dal National Institutes of Health (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).

Materials

MHC-I monomer NIH tetramer core facility Materials for MHC-tetramer preparation
ExtrAvidin-FITC Sigma-Aldrich E2716 Materials for MHC-tetramer preparation
Normal goat serum Jackson Immunoresearch 005-000-121
Low melt agarose Promega V3121
Heparin Sigma-Aldrich SLBL6391V
Triton X-100 Sigma-Aldrich T-6878
Urea J.T.Baker 4204-05
Glycerol/gelatin Sigma-Aldrich SLBH2672V
n-propyl gallate Sigma-Aldrich P3130
rat-a-h-CD8 (1:500) Acris 0714 Antibody unstable, use single use frozen aliquot
m-a-h-CD20 (1:500) NOVOCASTRA 6026819
m-a-h-Ki67 (1:500) Vector 6022201
goat-a-m-A488 (1:2000) Jackson Immunoresearch 124083
goat-a-rb-Cy3 (1:5000) Jackson Immunoresearch 106232
goat-a-rat-Cy5 (1:5000) Jackson Immunoresearch 118088
goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5000) Jackson Immunoresearch 86579
Compresstome: VF-300 Microtome Precisionary Instruments, LLC 1079
Quick Set Instant Adhesive Loctite 46551
24-well flat bottomed tissue culture plates Falcon 353226
Microscope slide Globe scienfitic Inc. #1321
Razor  blade Ted Pella, Inc 121-6
Feather Disposable Scalpel FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. No. 21
Round paintbrush #2 PRINCETON ART & BRUSH CO. 4350R Can trim as needed with razor
Confocal Microscope Olympus FV1000
FV10-ASW_Viewer4.0 Olympus

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Li, S., Mwakalundwa, G., Skinner, P. J. In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues. J. Vis. Exp. (127), e56130, doi:10.3791/56130 (2017).

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