Summary

大動脈リング共培養アッセイ:体外間葉系間質細胞の血管新生の可能性を評価するために便利なツール

Published: September 18, 2017
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Summary

ここでは、prelabelled の間葉系細胞がラット大動脈由来血管内皮ネットワークとの共培養して大動脈リング測定の新たな応用を提示します。この手法では、間葉系間質細胞 (MSCs) ホーミングと内皮細胞ネットワークとの統合の可視化、ネットワークのプロパティの定量化と MSC immunophenotypes と遺伝子発現の評価をことができます。

Abstract

血管新生は複雑で規制の厳しいプロセスを提供し、適切な組織灌流を維持する役割を担います。十分な血管のメンテナンスおよび病理学的奇形は、過度に豊富な血管新生は癌や炎症性疾患に関連付けられている重篤な虚血性疾患の起因できます。プロ血管新生療法の有望なフォームは、血管を新しく開発するため規制の要因だけでなく、物理的なサポートを提供することができます血管新生細胞源の使用です。

間葉系間質細胞 (MSCs) は、虚血や炎症を起こしている組織に家を検出してそのパラクライン効果と自分の能力のための血管再生のため広範囲調査候補です。特に、最初の学期はひと臍帯血管周囲細胞 (FTM HUCPVCs) の周皮細胞のような性質、高い増殖能とポテンシャル、免疫特権プロパティ、および堅牢なパラクリンのための非常に有望な候補者プロファイル。潜在的血管新生細胞を効果的に評価、信頼性の高いにそれらと「翻訳」の前臨床アッセイをテストする前提条件です。大動脈リング アッセイは管状の内皮構造の簡単な定量化を可能、ホストからアクセサリー支持細胞と細胞外マトリックス (ECM) を提供します、炎症性成分を除外、 ex vivo血管新生モデル高速かつ安価で設定します。これは生体内でモデル (例えば、角膜の試金、マトリゲル プラグ法) と比較されたとき有利です。大動脈リング アッセイは、投与細胞を追跡し、異種免疫拒絶反応を回避しながら細胞間の相互作用を観察できます。

応用発展途上ラット大動脈内皮細胞ネットワークとの共培養でヒト MSCs を含む大動脈リングの試金のためのプロトコルを提案します。この試金は、チューブの形成と物理的周皮細胞のような相互作用を開発する MSC の貢献とその効力積極的に血管新生のサイトに移行するため、実行して仲介する能力を評価するための分析ECM の処理。このプロトコルは、次の共培養 MSC の表現型と遺伝子発現の変化に関するさらに詳しい情報を提供します。

Introduction

血管新生の複雑なプロセスを向上させるし、既存の血管1から新しい血容器開発を促進することによって組織の灌流を維持します。それプロ血管新生と血管新生因子によって厳しく規制された、バランスの取れたプロセスです。このシステムの不備不足容器メンテナンスや成長、心筋疾患、脳卒中、神経変性疾患など重篤な虚血性疾患を引き起こす可能性があります。しかし、誇張された血管の開発は、がんや炎症性疾患2などの条件のための特徴です。

有利な組織の再生を達成するために血管新生を制御することを目指す治療法の開発は、重要です。広汎な前臨床および臨床調査にもかかわらずプロ血管新生因子とマイクロ Rna を用いた血管新生を刺激する試みは、望ましい結果3,4,5を達成するために失敗しました。一時的な効果のある可能性があります: 血管新生タンパク質と核酸、有限数の限られた寿命は成長因子6,7を対象とします。可溶性血管新生因子が血管新生を開始するために不可欠であるメンテナンスや血管の機能サポートするペリサイトおよび平滑筋細胞8を含むセルの種類に依存します。プロ血管新生療法の分野は、血管、さらに差別化の自己更新または物理的に新しくサポート開発中血管新生因子、ローカルを提供可能性があります潜在的な幹細胞と前駆細胞源を模索しています。血管内皮細胞 –9,10。これらの機能の要件を満たすために機能を備えた携帯型最適な血管新生を見つける虚血組織再生のための大きい約束を保持します。

潜在的な細胞ベースの治療法を臨床試験に正常に訳し、前臨床試験の有効性を実証し、血管新生機構の解明を強調表示する必要があります。確立された血管新生アッセイの数が多いにもかかわらず、フィールドは確実に潜在的な候補のセル型11,12,の有効性を評価できる「ゴールド スタンダード」の in vitroアッセイを欠いている13. ほとんどの in vitro血管新生アッセイ (内皮細胞の増殖, 移行および管の形成アッセイを含む) 通常内皮細胞表現型変化や分化細胞や化合物の効果の評価鋼管およびネットワーク構造14,15。これらの機能は血管新生に重要な「翻訳」アッセイも評価: 1) 豊胸術や血管や平滑筋細胞、2) ECM や基底膜の処理を含むサポートのセル型の交換と 3)。機能的な血管の形成を促進する効率。角膜アッセイ、マトリゲル プラグ アッセイを含む血管新生モデル生体内でユニークな生体内の微小環境を再現が追跡管理セルの難易度物理的な相互作用の観察に挑戦しています。さらに、生体内でモデル、潜在的な同種細胞療法の候補者16のテスト中 xeno 免疫拒絶反応が行われます。特に大動脈リング分析を提供できる血管新生モデル前のヴィヴォ: 1) 簡単に観察、3) ECM ホストや人工の電源で 4) 炎症性の排除 2) アクセサリー支持細胞管状構造の定量化コンポーネント、および 5) 迅速かつ安価なセットアップ17,18。通常、大動脈リング アッセイは、小さな分泌蛋白質、薬理学的エージェント、およびトランスジェニック齧歯類モデル19,20,21の血管新生可能性をテストできます。

MSCs は、その傍分泌を介する効果22,23,24を通じて主に血管再生医療の有望な候補です。MSCs は、血管内皮増殖因子 (VEGF)、肝細胞増殖因子 (HGF) を含む主要血管新生因子を分泌する示されているインスリン様成長因子 1 (IGF-1)、基本的な線維芽細胞成長因子 (bFGF) と angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26。また、MSCs を検出することができ、虚血性または炎症に家組織、ただし、厳密なメカニズムはまだ調査中では。ますます、文献はほとんど MSCs 血管周囲細胞から生じるし、共同周皮細胞マーカーを表現し、ペリサイト27のように振る舞うことができる仮説をサポートします。HUCPVCs は、若いひと臍帯の血管領域から派生した MSCs の源です。彼らは、周皮細胞のような性質を持つ MSCs の人口を表し、FTM と用語のへその緒から特徴づけられています。FTM の HUCPVCs は CD146 と NG2、高い増殖能とポテンシャルの免疫特権プロパティを含む周皮細胞マーカーの高発現を示す、堅牢なパラクリン プロファイル28を表示します。FTM の HUCPVCs は、新しい血管周皮細胞のようなプロパティを介しての推進により負傷した組織の再生を促進するための理想的な候補者セル型です。

血管新生の可能性と人間の MSCs の周皮細胞のような性質をテストするのには血管新生アッセイの非常に限られた数が肯定的な利用可能な angiotropic 移行 (以下「ホーミング」という)、ECM 処理、および物理的な開発細胞のタイプ間の相互作用は、血管の開発に関する定量的データを取得しながら調べることができます。

ここ大動脈リング試金の新規アプリケーションを記述するプロトコルを提案する.人間の MSCs は発展途上ラット由来大動脈内皮細胞ネットワークとチューブの形成、成熟および恒常性への貢献を評価するために共培養.このバージョン大動脈リング アッセイの評価能力とホーム新生のサイトに実行し ECM 処理を仲介し、周皮細胞のような物理の確立を通じて内皮の管状の発展に貢献する細胞療法候補者の効能相互作用。培養内皮細胞ネットワーク形成の MSCs の純効果の定量化、細胞間の相互作用を観察することに加え、我々 はまた MSCs を共培養から分離するためのプロトコルを最適化されています。フローサイトメトリーと qPCR を実行、次の共培養 MSC の表現型と遺伝子発現の変化を特徴づけることが可能です。モデル セル型として発生初期と比較した (胎児期) と人間の MSCs の後半 (大人) ソース: FTM HUCPVCs とひと骨髄由来 MSCs (ボーマン)、大動脈リング アッセイで、それぞれ。とき血管再生への応用の検討の下で任意の物理的にサポートのセル型の血管新生の可能性を研究する大動脈リング試金を使用することができることを提案します。

Protocol

動物を含むすべての研究が行われ、到着のガイドライン 29 によると報告します。制度上の研究倫理委員会の承認 (南軍兵数 4276) とすべての研究を行った。プロシージャは大学健康ネットワーク (トロント、カナダ)、動物の世話委員会によって承認されたすべての動物、すべての動物を受け取った ケアおよび実験動物の使用のためのガイド、8 th 版 (に準拠し…

Representative Results

大動脈リング/MSC 共培養法を確立するための作業フローの図は、図 1に示されています。主な手順を含める: ラット大動脈隔離区分し大動脈リングの埋め込み、監視内皮発芽およびネットワークの開発と最後にラベリング、MSCs を管理します。内皮細胞ネットワーク解析のタイムライン共培養期間ごとに実行可能な解析のウィンドウの概要: 日 1、5…

Discussion

成功した大動脈リング アッセイ MSC の培養実験を設定するのにはいくつかの重要な段階があります。まず、最も重要なステップを分離し、大動脈を切断するときは、: 1) 大動脈; の胸部のセグメントのみを取得2) 慎重に分岐血管、結合および脂肪組織を削除して。3) 切削各測定間変動を制限する大動脈 (~ 1 mm) のセクションでさえ。第二に、大動脈リングの BME へ埋め込み成功は、この試金のた…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは次のスタッフ メンバーに感謝し、研究の人員: Andrée ゴーティエ ・ フィッシャー、マシュー Librach、ターニャ · バレット、Tharsan Velauthapillai、サラ Laronde。

Materials

Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

Referenzen

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).

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Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

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