Un système hybride de levure modifié pour les études d'interaction complexe-ADN de protéines hétérogènes
Summary
L'essai à un hybride de levure modifié décrit ici est une extension de l'essai à base d'hybride (Y1H) de levure classique pour étudier et valider l'interaction de l'ADN-complexe hétérologue-ADN dans un système hétérologue pour toute étude de la génomique fonctionnelle.
Abstract
Au cours des années, le dosage de la levure à un hybride s'est avéré être une technique importante pour l'identification et la validation des interactions physiques entre les protéines telles que les facteurs de transcription (TF) et leur cible d'ADN. La méthode présentée ici utilise le concept sous-jacent du Y1H mais est encore modifiée pour étudier et valider les complexes de protéines qui se lient à leur ADN cible. Par conséquent, on appelle l'essai à base d'un hybride (Y1.5H) de levure modifiée. Ce dosage est rentable et peut être effectué facilement dans un environnement de laboratoire régulier. Bien que l' utilisation d'un système hétérologue, la méthode décrite pourrait être un outil précieux pour tester et valider la liaison du complexe de protéines hétéromériques à leur (s) cible (s) d'ADN pour la génomique fonctionnelle dans tout système d'étude, en particulier la génomique végétale.
Introduction
En général, pour comprendre les interactions protéine-ADN, le dosage Y1H est le système préféré utilisé avec succès dans un laboratoire 1 . Le dosage basique de Y1H implique deux composants: a) une construction rapporteur avec un ADN d'intérêt cloné avec succès en amont d'un gène codant pour une protéine rapporteur; Et b) une construction d'expression qui générera une protéine de fusion entre le TF d'intérêt et un domaine d'activation de la transcription de la levure (AD). L'ADN d'intérêt est généralement appelé «appât» tandis que la protéine de fusion est connue sous le nom de «proie». Au cours des dernières années, des versions multiples du test Y1H ont été développées pour répondre à des besoins spécifiques avec leurs propres avantages 2 . Le test Y1H existant peut être mis en œuvre avec succès pour identifier et valider l'interaction d'une protéine à la fois avec son appât d'ADN, mais n'a pas la capacité d'identifier les interactions protéines-ADN hétérodimères ou multimériques.
"> La méthode décrite ici est une version modifiée du Y1H permettant aux chercheurs d'étudier simultanément plusieurs protéines se liant à leurs séquences d'ADN cible. L'objectif de ce dosage est d'exprimer la protéine d'intérêt avec un domaine d'activation (pDEST22: TF) et évaluer l'activation des régions d'ADN candidates fusionnées à un journaliste en présence et / ou en l'absence du partenaire protéinant interactif (pDEST32ΔDBD-TF) dans le système de levure. Ce dosage nous permettra de déterminer si l'interaction entre ces deux Les protéines sont nécessaires pour l'activation de la cible. Il s'agit d'un système compatible de clonage GATEWAY et donc possible d'utiliser dans un environnement de laboratoire régulier. Ce protocole est basé sur une transformation directe, ce qui facilite la co-transformation de différents TF dans un système de levure . Ainsi, il s'agit d'une stratégie avantageuse pour valider les complexes de protéines qui se lient à leurs cibles d'ADN possibles pour la validation moléculaire et fonctionnelle in vitro fOu tout système. Les techniques actuelles telles que les méthodes de purification par affinité Tandem (TAP) sont coûteuses et nécessitent beaucoup de main-d'œuvre, mais permettent de détecter des protéines hépatiques à grande échelle 3 , 4 , 5 . Cette levure modérée à un hybride peut être exécutée avec succès dans un calcul de laboratoire régulier sur une petite échelle ( figure 1 ) et est également rentable. Le test Y1.5H peut aider les chercheurs de la communauté à tester et à valider leur hypothèse afin de définir le rôle de la liaison du complexe de protéines multimériques à une cible d'ADN commune en utilisant un système hétérologue. Sur la base des résultats, l'hypothèse pourrait être validée in vivo dans le système d'étude préféré. Récemment, nous avons utilisé cette approche pour définir le rôle d'un TF et son mode d'action pour réguler la floraison dans Arabidopsis 6 .Protocol
Representative Results
Discussion
La procédure standard Y1H existante est appropriée pour identifier une proie protéique unique se liant à son appât d'ADN. Avec diverses modifications techniques, le système existant a été exploité pour définir les réseaux réglementaires transcriptionnels. Cependant, les TF sont connus pour fonctionner comme une partie des complexes impliquant deux ou plusieurs TF ou protéines, avec seulement une partie du TF capable de se lier à l'ADN. Les protéines ou TF qui ne possèdent que les domaines de liai…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions SS Wang, M. Amar et A. Galla pour la lecture critique du manuscrit. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l'Institut national des sciences médicales générales des Instituts nationaux de la santé selon les numéros de récompense RO1GM067837 et RO1GM056006 (à SAK). Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.
Materials
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
Referenzen
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