JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Ergebnisse
Discussion
Offenlegungen
Acknowledgements
Materials
Referenzen
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Entwicklungsbiologie

Yüksek Çözünürlüklü Episkopik Mikroskopi (HREM) - Organik Malzemelerin İşlenmesi ve Görselleştirilmesi için Basit ve Sağlam Protokoller

Published: July 07, 2017
doi:
10.3791/56071
, , ,
1Division of Anatomy, Center for Anatomy and Cell Biology & MIC,Medical University of Vienna

Summary

Yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi yöntemi ile sayısal hacim veri üretmesine izin vermek için, çeşitli türlerin biyopsi materyali, biyomedikal model organizmaların embriyoları ve diğer organik dokuların numunelerinin işlenmesi için basit ve sağlam protokoller sunuyoruz.

Abstract

Yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi (HREM) yöntemiyle dijital ses verileri üretmek için basit protokoller sunuyoruz. HREM, 1 x 1 x 1 ve 5 x 5 x 5 μm 3 arasında tipik sayısal çözünürlüklerde 5 x 5 x 7 mm 3 hacimdeki organik malzemeleri görüntüleme kapasitesindedir. Numuneler, metakrilat reçinesine gömülmüş ve bir mikrotom üzerinde kesitlenmiştir. Her bölümden sonra blok yüzeyinin bir görüntüsü bileşik mikroskop başlığına bağlı fototüp üzerinde bulunan bir dijital video kamera ile yakalanır. Optik eksen bir yeşil flüoresan proteini (GFP) filtre küpünü geçer ve her bölümden sonra tutma yeri tutma kolunun durduğu bir konuma hizalanır. Bu şekilde, daha sonraki blok yüzeyleri gösteren doğal olarak hizalanan dijital görüntü dizisi üretilir. Böyle bir görüntü serisini üç boyutlu (3D) görselleştirme yazılımına yüklemek sanal hacimlere izin veren dijital hacim verilerine derhal dönüştürmeyi kolaylaştırırÇeşitli dik ve eğik düzlemlerde hareket etme ve hacim ve yüzey oluşturan bilgisayar modelleri oluşturma. Fare, civciv, bıldırcın, kurbağa ve zebra balık embriyoları, insan biyopsisi materyali, kaplanmamış kağıt ve cilt yenileme materyali dahil olmak üzere organik numunelerin çeşitli gruplarını işlemek için üç basit, doku spesifik protokolü sunuyoruz.

Introduction

Organik ve anorganik materyallerin yapısal analizi, fiziksel özelliklerini ve fonksiyonlarını anlamak için ilk adımdır. Bu analizin temelleri, doku mimarisi, hücre morfolojisi ve topoloji, moleküler kompozisyon ve biyomekanik özellikler 1 , 2 , 3 ve 4'ün detaylarını çıkaran basit ve sofistike görüntüleme yöntemleri ile histolojik bölümlerin dikkatle gözlemlenmesiyle kazanılan iki boyutlu (2D) 2 , 3 . Bununla birlikte, 2D bilgi, mekansal olarak karmaşık düzenlemeleri araştırmak için uygun değildir. Dolayısıyla sayısal hacim verilerinin üretilmesine izin veren artan sayıdaki canlı ve eks vivo yöntemler son on yılda kurulmuştur ve daha birçoğu gelişme halindedir.

En hacimli veri üretme yöntemlerinin metodik ilkesi sanal yığınların üretilmesidirBir nesnenin sanal veya fiziksel kesitlemesiyle elde edilen bölümleri görüntüleyen dijital görüntüler. Kesit görüntüleri düzgün şekilde hizalandıysa, bu sanal kesit düzlemlerinde yeniden kesitlendirilebilen veya 3D yüzey ve hacim oluşturulan modeller oluşturmak için kullanılan bir hacim oluşturur. Manyetik rezonans tomografi (MRT), bilgisayarlı tomografi (BT), pozitron emisyon tomografisi (PET) ve tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) insan ve daha büyük biyolojik örneklerin görüntülenmesine yönelik popüler tekniklerdir. Küçük numuneler genellikle mikro-manyetik rezonans görüntüleme (μMRI), optik projeksiyon tomografisi (OPT), optik koherens tomografi (OCT), fotoakustiksel tomografi (PAT), histolojik kesit alma esaslı yöntemler, konfokal mikroskopi ve elektron tomografi kullanılarak görüntülenir 5 , 6 , 7,8,9,10 <s11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Küçük numunelerin ve histolojik doku örneklerinin dijital verilerini üreten nispeten yeni bir hacim veri oluşturma tekniği, Tim Mohun 18 , 19 ile yakın işbirliği içinde geliştirilen HREM yöntemidir. Bir mikrotom üzerinde kesilen reçine gömülü malzemeden dijital ses verileri üreten basit bir mikroskop tabanlı tekniktir. Veriler, doku mimarisi ve hücre dağılımlarının detaylı analizinin yanı sıra orta ışık mikroskopik düzeyde küçük özelliklerin metrik analizi de kolaylaştırıyor.

HREM, özünde hizalanan dijital görüntü yığınlarını üretir; sanki eOsin lekeli histolojik kesitler. Görme alanına göre doku kontrastı ve veri çözünürlüğü, μCT, μMRI ve OPT ile üretilen verilerinkini aşar, ancak konfokal, ışık saçılımı ve elektron mikroskobu ile elde edilenden daha düşüktür. Bununla birlikte, HREM, sonuncunun aksine, histolojik kalitede, 5 x 5 x 7 mm 3'e kadar göreli büyük hacimlerde örnekleri görselleştirebilir. Yakın tarihli bir dizi araştırma, tek görüntüleme tekniklerinin avantajlarının ve dezavantajlarının ayrıntılı karakterizasyonu ve karşılaştırmalarını sağlar ve objektiflik uğruna, sınırlamaları ve potansiyel uygulama alanları 4 , 21 , 22 , 23 , 24 .

Bu çalışmada HREM görüntüleme yöntemi üzerinde durulmaktadır.Geniş bir organik materyal yelpazesinin HREM verilerini üretmek için çok basit protokoller ve bunların uygulama örnekleri. HREM verilerini oluşturmak için iş akışı basittir ve metakrilat reçinesine yerleştirebilen tüm malzemeler için geçerlidir ( Şekil 1 ). Ancak, numune hazırlamada dikkate alınması gereken doku spesifik farklılıklar vardır. Bu nedenle, çeşitli numuneleri hazırlamak için üç standart protokol öneriyoruz. Katıştırma ve veri oluşturma protokol adımları hepsi için aynıdır.

Protocol

Bütün işlemler, Viyana Tıp Üniversitesi'nde etik kurallara uygun olarak gerçekleştirildi. 1. Örnek Hazırlama Embriyoların ve embriyo dokularının hazırlanması (5 x 5 x 5 mm 3'e kadar ) Embriyoları veya embriyoların parçalarını 4 ° C PFA / PBS'de veya Bouin's fiksatifinde 4 ° C'de en az 16 – 24 saat boyunca sabit dalgalanma altında sabitleyin. NOT: Burada kullanılan 48 saat zebra balığı, 19 saat civciv ve bıldırcın ve ayrıca prenatal fare embriyoları gibi çeşitli türlerin ve çeşitli gelişim evrelerinin embriyoları kullanılabilir (bkz. Temsilci Sonuçlar ). Numuneler hasat edildi ve fiksatif hale getirilmeden evreleme için oda sıcaklığında PBS'ye aktarıldı. Gerekirse, gömme kalıplarına uyması için sabitlemeden önce numuneleri mikro makas veya bisturi ile kesin. Sabitleştirici çıkarın ve sabit taş altında 4 ° C'de PBS içinde embriyo dokusu yıkayınG 24 saat (2-3 değişiklik). Numuneleri% 70,% 80,% 90,% 96 etanolde 4 ° C'de 2 – 3 saat boyunca kurutun. Numuneleri içeren tüpleri bir rotatöre yerleştirin. NOT: Küçük numuneler (<2 x 2 x 2 mm 3 ) için, bir numunenin her etanolde durduğu süre 60 dakikaya düşebilir. Büyük örnekler (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) için, 4 saate kadar uzatılabilir. Koruyucu eldiven giymiş bir tüp kapağının altına sızma adımlarını uygulayın. 1.25 g benzoil peroksit (plastikleştirilmiş katalizör) ve 0.4 mL eozini 100 mL A solüsyonuna ekleyerek sızıntı solüsyonunu hazırlayın (daha ayrıntılı bilgi için, Malzeme Tablosuna bakın). Bunu eozin ve katalizör tamamen eriyene kadar (2 – 3 saat) 4 ° C'de bir manyetik karıştırma plakasında bir beher içerisinde karıştırın. Numuneleri 12 – 24 saat boyunca sızma çözümüne yerleştirin. Sürekli sallama veya döndürme altında 4 ° C'de tutun. Sızıntı solüsyonunu 3 ve 12 saat sonra taze solüsyonla değiştirinh. NOT: Büyük embriyolar için infiltrasyon süresini 48 saate çıkarın (> 1 cm taç / kıç uzunluğu). Yetişkin doku örnekleri hazırlama (5 x 5 x 7 mm 3 e kadar ) 4 ° C'de en az 3 gün% 4 karbolik asit içeren% 2 PFA / PBS içinde dokuları düzeltin. NOT: Bu solüsyonda birkaç yenidoğan ve erişkin insan, kemirgen, domuz, meyve sinekleri ve zebra balıklarının deri, karaciğer, pankreas, böbrek, tiroit, kalp, çizgili kas, beyin, sinirler ve tümör modellerinden kaynaklanan doku örneği tespit edilebilir Ve daha sonra HREM görüntüleme için işlendi (örneklerin sabitlenmesini gösterdik, Temsilcilik Sonuçlarına bakınız). Doku numunelerini neşterler, makaslar veya biyopsi zımbalarla ayırın ve doğrudan fiksatif maddeye aktarın. Sinir dokusunun fiksasyonu için% 4 PFA / PBS kullanın. Sabitleyiciyi çıkarın ve dokuyu akan musluk suyu altında 3-6 saat boyunca yıkayın. Daha sonra plac ile numuneleri kurutun% 70,% 80,% 90,% 96 etanol, 100 mL (her biri 2-3 saat) için 0.4 g eosin ile karıştırılmışlardır. Çözeltileri 4 ° C'de sabit sallanan veya rotator üzerinde tutun. NOT: Küçük numuneler (<2 x 2 x 2 mm 3 ) için, bir numunenin her etanolde durduğu süre 60 dakikaya düşebilir. Büyük örnekler (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) için 4-8 saate kadar uzatılabilir. Koruyucu eldiven giymiş bir tüp kapağının altındaki aşağıdaki sızma adımlarını gerçekleştirin. 1.25 g benzoil peroksit (plastikleştirilmiş katalizör) ve 100 mL A solüsyonuna 0.4 g eozin ekleyerek sızıntı solüsyonunu hazırlayın (daha ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın). Eozin ve katalizör tamamen çözünene kadar (2 – 3 saat) manyetik bir karıştırma plakasındaki bir beherde 4 ° C'de karıştırın. Numuneleri 24 ila 36 saat boyunca sızıntı solüsyonuna yerleştirin. Sürekli sallama veya döndürme altında 4 ° C'de tutun. 3 ve sonra sızıntı solüsyonunu taze solüsyonla değiştirin.12 saat. NOT: Büyük örnekler (> 5 x 5 x 5 mm 3 ) için sızma süresini 48 saate çıkarın. Diğer organik maddelerin hazırlanması NOT: Cildin yerini alan maddeleri ve kağıtları sıradan bir makasla istenen ebatta kesin. Düzeltme gerekmiyor. Sabitleme, yıkama ve dehidrasyon adımlarını atlayın. Koruyucu eldiven giymiş bir tüp kapağının altındaki aşağıdaki sızma adımlarını gerçekleştirin. 1.25 g benzoil peroksit (plastikleştirilmiş katalizör) ve 100 mL A solüsyonuna 0.4 g eozin ekleyerek sızıntı solüsyonunu hazırlayın (daha ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın). Eozin ve katalizör tamamen eriyene kadar (2 – 3 saat) manyetik bir karıştırma plakasında 4 ° C'de bir beherde karıştırın. Örnekleri 3-12 saat boyunca sızıntı solüsyonuna yerleştirin. Sürekli sallama veya döndürme altında 4 ° C'de tutun. 1 ve 2 ila 4 saat sonra infiltrasyon solüsyonunu yeni solüsyon ile değiştirin. </ Li> 2. Yerleştirme NOT: Koruyucu eldiven giymiş bir duman kaputunun altındaki tüm basamakları gerçekleştirin. Yukarıda açıklandığı gibi taze sızma çözümünü hazırlayın (adım 1.1.4.1). Gömme solüsyonunu hazırlamak için 100 mL sızma solüsyonuna 4 mL B çözeltisi (ayrıntılar için, Malzeme Tablosuna bakın) ilave edin. NOT: Gömme kalıplarındaki numunenin hassas yönlendirilmesi gerekiyorsa ve birkaç numunenin paralel olarak yerleştirilmesine izin vermek için, beheri bir buz banyosuna koyarak stok solüsyonunun polimerizasyonunu yavaşlatın. Rutin bir hacim 6 x 8 x 5 mm 3 veya 13 x 19 x 5 mm 3 olan kalıplar ile kalıplama fincan tepsileri (ayrıntılar için, Malzeme Tablosuna bakın) veya 8 x 10 x 15 mm'ye kadar hacimlere sahip özelleştirilmiş kalıplar kullanın 3 ( Şekil 2 ). Kalıpları gömme çözeltisi ile doldurun ve numuneyi kullanarak kalıba aktarın.Bir kaşık. Aktarım sırasında, hava tutma özelliğini önlemek için numunenin gömme çözeltisi ile tamamen örtülmesini sağlayın. NOT: Örnekleri ve gömme çözeltisini buzdolabından topladıktan hemen sonra başlatılırsa, oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. İğneleri veya forsepsi kullanarak kalıp içindeki numuneyi yönlendirin. Gömme çözeltisi yapışkan olmaya başladığında, kalıbın üzerine bir blok tutucu ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin ve blok tutacağının orta deliğinden gömme çözeltisini 1 – 2 Mm gömme çözümü. Sıvı parafin mumu ile kaplayarak kalıplama kabının tepsisini kapatın ve sertleşene kadar bekleyin. Alternatif olarak, ikinci bir kalıplama fincan tepsisini örneklerle kalıp fincan tepsisine baş aşağı yerleştirin ve hava geçirmez hale getirmek için yapışkan bantla kapatın. Blokların polimerleşmeyi bitirmesine izin verin 1 -Oda sıcaklığında 2 gün. Polimerizasyon sonrası işleme için, polimerize bloklar içeren kalıplama kabı tepsilerini standart bir laboratuar fırınına yerleştirin ve koyu kırmızıya gelene kadar 70 – 80 ° C'de en az 1 – 2 gün pişirin. Tepsileri fırından toplamak ve kalıplardan blokları çıkarmak. NOT: Pişirme normal çevre koşullarında yapılabilir. Gömülmeden sonra ilk aşamada havaya dayanıklı sızdırmazlığı sağlayan kaplama kalıplama kabı tepsisi, 10 saat sonra reçinenin rengini kontrol edebilmek için çıkarılabilir. Fırınlamadan hemen sonra, reçine yumuşaktır ve bloklar kalıplama kabı tepsiden kolaylıkla çıkarılabilir. 2 – 3 saat içerisinde serttirler ve birkaç ay boyunca oda sıcaklığında saklanabilirler. 3. Veri Üretimi NOT: Burada kullanılan 18 , 25 numaralı HREM prototipi aşağıdaki maddeleri içermektedir: (i) Blok tutuculu döner mikrotomHer kesimden sonra üst dönüş noktasında durur. (Ii) Standart, tek kullanımlık olmayan mikrotom bıçak, sert metal, profil D (ayrıntılar için bkz . Malzeme Tablosu ). (Iii) Objektif revolver ve optik eksende bir GFP-filtre küpü (uyarılma 470/40; emisyon filtresi 525/50) ile floresan bileşik mikroskop başı. Optik eksen, mikrotom üzerine monte edilmiş bir bloğun yeni kesilen yüzeyine dik olarak düzenlenmiştir ve yukarı ve aşağı hareketi sağlayan bir cihaz tarafından tutulmaktadır. (Iv) Mikro topağı taşıyan motorlu çapraz masa. Masa, optik eksen yönünde ve yanal olarak kaydırılabilir. (V) Floresan bileşik mikroskopta takılı dijital video kamera. (Vi) Tek renkli ışık kaynağı (470 nm). (Vii) Bilgisayara bağlı bilgisayar, veri üretme yazılımı ile (ayrıntılar için bkz . Malzeme Listesi ). prosedür İlgi alanını belirtin. Standart laboratuvar li kullanınBeyaz ışığın blok yüzeyine eğik bir şekilde yönlendirilmesi için ght kaynağı ( Malzeme Tablosuna bakınız). Gömülü malzemenin blok yüzeyine çıkarken çizgilerini belirleyin. Bir kalem veya tıraş bıçağıyla blok yüzeyindeki ilgi alanını ve daha sonra görme alanını belirtin. NOT: Bu adım, kesitlendirme öncesi alanın kapsamını tanımlamak için zorunludur. Görüş alanını tanımlayın. Reçine bloğunu örnekle mikrotom üzerine yerleştirin. Blok tutucuyu durma konumuna (blok tutucu gezinin üst dönüş noktası) hareket ettirin. Dijital fotoğraf makinesi ve veri oluşturma yazılımını başlatın ve canlı görüntü elde edin. Blok yüzeyinde belirtilen ilgi bölgesini kapsayacak uygun bir büyütme ile bir objektif lens seçin. NOT: 2.5X, 5X, 10X, 20X büyütmeler ve 0.07 ile 0.40 arasında sayısal açıklıklar olan nesneler yaygın olarak kullanılır. </li> Optik yukarı ve aşağı hareket ettirin ve mikrotomu, ilgi alanının bilgisayar ekranında görüntülenen alanla eşleşene kadar motorlu çapraz tabloyu kullanarak yanal olarak hareket ettirin. Odaklanın. Numunenin ilk yapıları görünene kadar adım adım manuel kesit alma işlemini gerçekleştirin. Mikro topuzu optik eksen yönünde hareket ettirerek blok yüzeyini optik odak düzleminde düzenleyin. Kesit kalınlığını seçin; 0.5 ila 5 μm kesit kalınlıkları önerilir. Veri üretimi ve işlenmesi Bölümleme ve resim yakalamayı düzenleyen yazılım rutini başlatın. Görüntü yakalama yazılımının belgelenmiş talimatlarını izleyin. Yazılım rutini durdurun ve numune tamamen kesildiğinde blok yüzeyinin önüne ölçekleme slaydını yerleştirin. Daha sonraki kalibrasyon için görüntüyü etkileşimli olarak yakalayınsiyon. NOT: Bu, yeni düzenlenmiş bir kurulumda bir objektif her kullanıldığında yapılmalıdır. Görüntü serisini in.jpg formatında 8 bit gri ölçekli görüntülere dönüştürün. Görüntü serisini 3D görselleştirme yazılımına yükleyin ve kontrastları ayarlayın. NOT: Görüntü dönüşümü ve 3D görselleştirme, ilgili yazılımın talimatlarını izleyerek, çeşitli ticari veya serbestçe temin edilebilir standart yazılım paketleri ile yapılabilir.

Representative Results

HREM, hematoksilen / eozin boyalı histolojik bölümlerin görüntülerine benzeyen kontrastlı, özünde hizalanmış dijital görüntü dizisi üretir. 2D kesit görüntülerin aksine, HREM görüntü yığınları, 3D organik materyallerin çok çeşitli doku mimarisi, morfolojisi ve topolojisinin görselleştirilmesi ve analizi için olanak tanır. Yüksek kontrast, genellikle, hacim oluşturulan bilgisayar modellerinin hızlı ve basit bir şekilde görselleştirilmesini ve yüzey render modellerin üretilmesi için yarı otomatik kontur bulgularını kolaylaştırır. HREM verilerinin boyutu, kamera hedefinin boyutuna, görüntü yakalama moduna (8, 12, 16 bit, gri tonlama, renk) ve tek blok yüz görüntülerinin sayısına göre değişir. 2,048 piksel x 2,048 piksel boyutundaki 1.000 8 bit.jpg gri tonlama görüntüsü için daha küçük veri setleri yaklaşık 900 MB'lık bir boyuta sahiptir. 3.000 8-bit.jpg gri ölçekli 4,096 p'lik daha büyük veri setleriIxel x 4.096 piksel, yaklaşık 20 GB hacimde. Sağlanan protokoller basit ve sağlamdır ve son on yılda birçok farklı numunenin HREM verilerini üretmek için istihdam edildi. Protokol 1.1 bölümü, 1 cm'ye kadar bir uzunluktaki biyomedikal model organizmaların bütün embriyolarını ve 5 x 5 x 5 mm3'e kadar bir boyuta sahip embriyo dokusu örneklerinin işlenmesi için optimize edilmiştir; Fare ( Mus musculus) , civciv ( Gallus gallus ), zebra balığı ( Danio rerio ), bıldırcın ( Coturnix coturnix) , Afrika pençe kurbağa ( Xenopus laevis ), at ( Equus ferus caballus ), süt tohumu böceği ( Oncopeltus fasciatus ), timsah ( Crocodylia ) ve ahtapot ( Ahtapot vulgaris ). Tüm türlerin verileri mükemmel kalitede idi ( örn . Şekil 3 ) <p clProtocol section 1.2, 5 x 5 x 7 mm 3 e kadar boyutlara sahip genç ve yetişkin doku numunelerinin işlenmesi için optimize edildi ve doku numunelerinin görüntülenmesi için kullanıldı. Insanlardan ( Homo sapiens ), farelerden ( Mus musculus ), sıçanlardan ( Rattus norvegicus ), domuzlardan ( Sus scrofa domestica ) ferreti ( Mustela'dan ) alınan karaciğer, pankreas, böbrek, tiroit, kalp, çizgili kas, beyin, sinirler ve tümör modelleri Furo ), meyve sineği ( Drosophila melanogaster ) ve zebra balığı ( Danio rerio ). Sonuçlar en örneklerle ( Tablo 4 , Animasyon 1 ) mükemmel iken (epidermisli) cildin merkez kısımları ve beyin örnekleri 3 x 3 x 3 mm 3'den daha büyük eozinin penetrasyon yetersizliğinden dolayı lekelenmemiş olarak kaldı Bu dokular. Protokol sEction 1.3, elyaflı organik materyallerin işlenmesi için optimize edildi ve kaplanmış kağıt, kaplanmamış kağıt, yerli dermal yerine geçen materyal ve kök hücresi tohumlanmış dermal yerine geçen materyalin elyaf mimarisini görselleştirmek için kullanıldı. Bu örneklerin işlenmesi kolay ve hızlıydı. Kaplamasız kağıt ve çoğu cilt kullananların verileri iyi kalitede idi ( Şekil 5 , Animasyon 2 ). Anorganik madde eozinin nüfuz etmesini engellediğinde kaplamalı kağıdın işlenmesinde sorunlar oluştu. Bir başka sorun, agar temelinde cilt ikame işleminde ortaya çıktı, çünkü kısmen sızma çözeltisi tarafından sindirildi. Şekil 1: İş Akışı. Kırmızı kutularda gösterilen basamaklar örnek özelliklerine göre değişiklik gerektirir. Yeşil kutulardaki basamaklar,Tüm örneklerde benzerdir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 2: Özel kalıplar. Kalıplar orijinal kalıba bir delik açarak, bir Pasteur pipetinin ampulünü yerleştirerek ve model materyaliyle sızdırmaz şekilde uyarlanabilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3: Örneklem Görsel Embriyolar. (A, B) Embriyonik günde hasat edilen fare embriyo E = 9.5. HREM kesit görüntüsü, (A) </strong>. Cildi oluşturan hacim gösteren 3D model (B) ' de gösterilmiştir. (C) E15.5 fare embriyo boynu hacim render model vasıtasıyla Sanal sagital kesit. (D) Gelişimsel Hamburger Hamilton (HH) evresindeki civciv embriyo 18. Kardiyovasküler bileşenlerin lümeninin yüzey modeli, tüm embriyo dokularının hacim oluşturma ile kombine edilmiştir. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 4: Örnek Görülen Yetişkin Doku Örnekleri. (A) HREM bölümünün bir parçası bir insan siniri vasıtasıyla imge. Yerleştirme, görüntünün bir bölümünü daha ayrıntılı gösterir. (B) Domuz karaciğeri yoluyla HREM bölümünün bir parçası. N'yi not edinuclei. (C) İnsan lenfatik dokusunun bir HREM bölüm görüntüsünün bir parçası. (D, E) Bir insan parmak başlığının kalın cildi. Hacim tüm biyopsinin 3D modelini oluşturdu. (D) HREM verileri (E) yoluyla sanal rezeksiyonun önündeki damar, damar ve sinir modellerini yüzey oluşturdu. (F) Yetişkin fare dokusunda deneysel tümör. Hacim, HREM verileri aracılığıyla üç sanal bölümün önünde 3D model oluşturdu. Nekrotik parçaları not edin (ok uçları). Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 5: Örnek Olarak Görselleştirilen Lifli Materyal. (A, B) Kaplanmamış kahverengi kağıdın HREM kesit görüntüsü. (B) </sTrong>, (A) ' nın bir bölümünü gösterir. Lifleri ve lümenlerini not edin. (C) kaplanmış kağıt HREM bölümü. Elyafların lekesiz kaldığını unutmayın. (D) Yerli deri yerine kullanılan materyalin hacim oluşturan modeli. Liflerin farklı kalibrelerine ve biçimlerine dikkat edin. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Animasyon 1: Bir İnsan Kılavuzluğunun Kalın Cildinin Hacim Üzerinde Oluşturulan Modeli. Doku bloğunun boyutu yaklaşık 4.2 x 2.7 x 2.7 mm 3'tür . Voksel boyut 1.07 x 1.07 x 2 μm3'tür. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.) <pclass > Animasyon 2: Native Dermal Substitute Malzemenin Hacim Arttırılmış Modeli. Numunenin boyutu yaklaşık 1.2 x 0.85 x 0.4 mm 3'tür . Voksel büyüklüğü 0.54 x 0.54 x 2 μm3'tür. Bu videoyu izlemek için lütfen tıklayınız. (İndirmek için sağ tıklayın.)

Discussion

HREM, biyotıp ve endüstride kullanılan geniş bir organik materyal spektrumunu görselleştirmek için ideal olan oldukça sağlam mikroskopik bir yöntemdir. 18 , 21 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 . Şu anda Gelişimsel Bozuklukların Mekanizmaları (DMDD) programı 41 , 42 tarafından kullanılan özel görüntüleme modeli olarak kullanılabilir <suP>, 43 , 44 ya da multimodal görüntüleme boru hatlarının bütünleyici bir parçası olarak 45 .

Tamamıyla çalışan bir HREM veri oluşturma aparatı, klasik laboratuvar bileşenleri kullanılarak monte edilebilir ve motorlu mikrotom, mikroskop, motorlu çapraz tablo ve uygun yazılımlı bir bilgisayar içerir. Tanımlanmış bir konumda her bölümden sonra tekrarlanabilir şekilde duran bir blok tutucu ile donatılmış bir mikro-topun kullanılması ve optik yolun içindeki GFP filtre küplerinin kullanılması kritiktir. Bununla birlikte, tamamen işlev gören her şey dahil çözümleri Indigo Scientific gibi şirketlerden satın alabilirsiniz.

HREM, tüm histolojik tekniklerle aynı kısıtlamalarla karşı karşıyadır, ancak bölümleme veya bölüm montajı esnasında herhangi bir artefakt gelmemiştir. Bununla birlikte, kesit alma öncesi numunelerin lekelenmesi gerekliliğinden kaynaklanan sınırlamalar vardır veGömme malzemesinin özelliklerinden. Yeterli doku kontrastının elde edilmesi için eosinin tüm numuneye nüfuz edilmesi gereklidir; Çok yoğun materyal, yağ dokuları ve anorganik maddeler, eozin penetrasyonunu etkili bir şekilde engeller ve bu, cisimlerin merkezinde lekelenmemiş dokulara neden olur. Özel fiksatif maddelerin kullanılması cilt örneklerinin lekelenmesine yardımcı olur, ancak sorunu tamamen çözmek için hala uygun bir yöntem yoktur. Bir diğer kısıtlama ise, 2 cm'den daha yüksek bloklu reçinelerin, kesitlendirme sırasında kırılma eğiliminde olmasıdır. Bu, kısmen numunelerin kesilmesi ve parçaların ayrı ayrı işlenmesi ile önlenebilir.

Gömme işlemi sırasında kalıplarda düzensiz yüzeylere sahip küçük numunelerin veya numunelerin doğru konumlandırılması sıklıkla sorun yaratmaktadır. Numuneleri agaroz ile örtmek ve protokolde açıklandığı gibi agaroz blokları işlemek genellikle bu sorunu çözer 19 . Bölümler sırasında blokların kırılmasına da yardımcı olan alternatif bir yaklaşımAçıklanan gömme prosedürünü takiben, zaten sertleştirilmiş bloğu tutucudan çıkarın ve yeniden katıştırın.

Tipik bir HREM veri seti, 500 ila 3.000 tek görüntü içerir. Sayısal çözünürlüğü, ardışık görüntüler arasındaki uzaklık ( yani , kesit kalınlığına göre), kamera hedefinin karakteristiği ve kullanılan optiklerin özellikleri tarafından belirlenir. Sunulan protokoller eserler 20 , 46'dan parlamayı tamamen ortadan kaldırmasa da, 1 μm ve 5 μm arasındaki kesit kalınlıklarını kullandık ve iyi sonuçlar elde ettik. Bu eserler, blok yüzeylerinin üstündeki doku bilgisinin bulanıklaşmasına neden olan, blokun derinlerinde bulunan yoğun şekilde lekelenmiş dokulardan kaynaklanır.

Kameraların hedef boyutları 2,560 x 1,920 piksel 2 , 2,048 x 2,048 piksel 2 ve 4,096 x 4,096 piksel 2 idi ve kombine1.25X, 2.5X, 5X, 10X ve 20X nesnel objektiflerle donatılmıştır. Bu, 0.18 x 0.18 μm2 ile 5.92 x 5.92 μm2 arasındaki sayısal piksel boyutlarıyla sonuçlandı ve doku mimarisi ve hücre şekillerinin 3D analizi için ve hatta çekirdekleri görselleştirmek için bile yeterli olduğu kanıtlandı. Yüksek sayısal çözünürlük göz önüne alındığında, diğer hücre organelleri de görünür olmalıdır. Basit eozin boyama ve hedeflerin optik özellikleri nedeniyle kontrastlar yetersiz yapıları ayırt etme olasılığını önemli ölçüde azaltır. Sayısal diyaframı hesaba katan HREM verilerinin maksimum gerçek mekânsal çözünürlüğü yaklaşık olarak 1 x 1 x 1 μm 3'tür ve bu nedenle yalnızca yaklaşık 3 x 3 x 3 μm 3'den daha büyük yapıların etkin ayrımına izin verir.

Tüm dijital görüntüleme tekniklerinde sık görülen bir problem, görüntüleme alanının büyüklüğü arasındaki tradeoff olup, bu da görüntülemenin yapılabileceği numunenin bölümünü tanımlamaktadırD ve kamera hedefinde sayısal çözünürlük. Görüş alanı büyüdükçe mümkün olan en üst düzeyde sayısal çözünürlüğü düşürür. Burada kullanılan HREM kurulumu, 0.18 x 0.18 μm2 ve 12.12 x 12.12 mm2 (1.25X objektif) sayısal çözünürlüklerde görüntülenen 0.74 x 0.74 mm2 (20X objektif) görüş alanı ile HREM verisinin oluşturulmasına izin verir. 2.96 x 2.96 μm 2'lik sayısal bir çözünürlük. Alternatif, ticarileştirilmiş kurulumlar, daha geniş görüş alanları sağlayabilir ancak gerçek çözünürlük pahalıdır. Bununla birlikte, DMDD programının ana sayfasında gösterilen verilerden de anlaşılacağı üzere, mükemmel sonuçlar vermektedir 47 .

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, örnek sunmak için HREM ve Petra Heffeter'in gelişmekte olan invalubale katkıları nedeniyle Tim Mohun'a teşekkür ediyorlar.

Materials

JB-4 Plus Embedding Kit Polysciences Europe GmbH 18570-1 includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B
Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177A-3
Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities) Polysciences Europe GmbH 17177C-3
JB-4 Plastic Block Holders Polysciences Europe GmbH 15899-50
Eosin Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma 1A-196
Microtec CUT 4060E rotary microtome
Leica DM LM, fluorescence compound microscope Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
GFP filter set Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H 11090937180000
Motorised cross table Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG KT5-LSMA
Digital video camera SPOT-FLEX Visitron Systems GmbH.
precisExcite High-Power LED Visitron Systems GmbH. light source
VisiView 2.1.4 Visitron Systems GmbH. Image capturing software
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H
KL 2500 LCD Schott AG light source
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referenzen

  1. Murray, K. K., Seneviratne, C. A., Ghorai, S. High resolution laser mass spectrometry bioimaging. Methods. 104, 118-126 (2016).
  2. Holzlechner, M., et al. In Situ Characterization of Tissue-Resident Immune Cells by MALDI Mass Spectrometry Imaging. J Proteome Res. 16 (1), 65-76 (2017).
  3. Elsayad, K., et al. Spectrally coded optical nanosectioning (SpecON) with biocompatible metal-dielectric-coated substrates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20069-20074 (2013).
  4. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29 (12), 700-711 (2013).
  5. Schneider, J. E., et al. High-resolution imaging of normal anatomy, and neural and adrenal malformations in mouse embryos using magnetic resonance microscopy. J Anat. 202 (2), 239-247 (2003).
  6. Sharpe, J. Optical projection tomography as a new tool for studying embryo anatomy. J Anat. 202 (2), 175-181 (2003).
  7. Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Dev Dyn. 238 (3), 632-640 (2009).
  8. Syed, S. H., Larin, K. V., Dickinson, M. E., Larina, I. V. Optical coherence tomography for high-resolution imaging of mouse development in utero. J Biomed Opt. 16 (4), 046004 (2011).
  9. Zhang, E. Z., et al. Multimodal photoacoustic and optical coherence tomography scanner using an all optical detection scheme for 3D morphological skin imaging. Biomed Opt Express. 2 (8), 2202-2215 (2011).
  10. Singh, M., et al. Applicability, usability, and limitations of murine embryonic imaging with optical coherence tomography and optical projection tomography. Biomed Opt Express. 7 (6), 2295-2310 (2016).
  11. Weninger, W. J., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-D reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anat Embryol (Berl). 197 (5), 341-348 (1998).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat Genet. 30 (1), 59-65 (2002).
  13. Khairy, K., Keller, P. J. Reconstructing embryonic development. Genesis. 49 (7), 488-513 (2011).
  14. Medalia, O., et al. Macromolecular architecture in eukaryotic cells visualized by cryoelectron tomography. Science. 298 (5596), 1209-1213 (2002).
  15. Berrios-Otero, C. A., Wadghiri, Y. Z., Nieman, B. J., Joyner, A. L., Turnbull, D. H. Three-dimensional micro-MRI analysis of cerebral artery development in mouse embryos. Magn Reson Med. 62 (6), 1431-1439 (2009).
  16. Liu, M., et al. Dual modality optical coherence and whole-body photoacoustic tomography imaging of chick embryos in multiple development stages. Biomed Opt Express. 5 (9), 3150-3159 (2014).
  17. Mohun, T. J., Leong, L. M., Weninger, W. J., Sparrow, D. B. The morphology of heart development in Xenopus laevis. Dev Biol. 218 (1), 74-88 (2000).
  18. Weninger, W. J., et al. High-resolution episcopic microscopy: a rapid technique for high detailed 3D analysis of gene activity in the context of tissue architecture and morphology. Anat Embryol. 211 (3), 213-221 (2006).
  19. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding Embryos for High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Cold Spring Harb Protoc. 2012 (6), 678-680 (2012).
  20. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Weninger, W. J. Visualizing vertebrate embryos with episcopic 3D imaging techniques. ScientificWorldJournal. 9, 1423-1437 (2009).
  21. Bruneel, B., et al. Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies. Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).
  22. Adams, D., et al. Bloomsbury report on mouse embryo phenotyping: recommendations from the IMPC workshop on embryonic lethal screening. Dis Model Mech. 6 (3), 571-579 (2013).
  23. Heddleston, J. M., Chew, T. L. Light sheet microscopes: Novel imaging toolbox for visualizing life’s processes. Int J Biochem Cell Biol. 80, 119-123 (2016).
  24. Powell, K. A., Wilson, D. 3-dimensional imaging modalities for phenotyping genetically engineered mice. Vet Pathol. 49 (1), 106-115 (2012).
  25. Geyer, S. H., Mohun, T. J., Kamolz, L. P., Weninger, W. J. High resolution episcopic microscopy – current applications. Current Biotechnology. 1 (4), 281-286 (2012).
  26. Weninger, W. J., Maurer, B., Zendron, B., Dorfmeister, K., Geyer, S. H. Measurements of the diameters of the great arteries and semi-lunar valves of chick and mouse embryos. J Microsc. 234 (2), 173-190 (2009).
  27. Geyer, S. H., Maurer, B., Dirnbacher, K., Weninger, W. J. Dimensions of the great intrathoracic arteries of early mouse fetuses of the C57BL/6J strain. The Open Anatomy Journal. 4 (1), 1-6 (2012).
  28. Geyer, S. H., Maurer, B., Pötz, L., Singh, J., Weninger, W. J. High-Resolution Episcopic Microscopy Data-Based Measurements of the Arteries of Mouse Embryos: Evaluation of Significance and Reproducibility under Routine Conditions. Cells Tissues Organs. 195 (6), 524-534 (2012).
  29. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Some Mice Feature 5th Pharyngeal Arch Arteries and Double-Lumen Aortic Arch Malformations. Cells Tissues Organs. 196 (1), 90-98 (2012).
  30. Kee, H. J., et al. Ret finger protein inhibits muscle differentiation by modulating serum response factor and enhancer of polycomb1. Cell Death Differ. 19 (1), 121-131 (2012).
  31. Geyer, S. H., Nohammer, M. M., Tinhofer, I. E., Weninger, W. J. The dermal arteries of the human thumb pad. J Anat. 223 (6), 603-609 (2013).
  32. Geyer, S. H., Weninger, W. J. Metric characterization of the aortic arch of early mouse fetuses and of a fetus featuring a double lumen aortic arch malformation. Ann Anat. 195 (2), 175-182 (2013).
  33. Maurer, B., Geyer, S. H., Weninger, W. J. A Chick Embryo With a yet Unclassified Type of Cephalothoracopagus Malformation and a Hypothesis for Explaining its Genesis. Anat Histol Embryol. 42 (3), 191-200 (2013).
  34. Geyer, S. H., et al. High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM): A Tool for Visualizing Skin Biopsies. Microsc Microanal. 20 (5), 1356-1364 (2014).
  35. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis Model Mech. 7 (10), 1143-1152 (2014).
  36. Geyer, S. H., et al. High-resolution episcopic microscopy (HREM): A useful technique for research in wound care. Ann Anat. 197, 3-10 (2015).
  37. Captur, G., et al. Morphogenesis of myocardial trabeculae in the mouse embryo. J Anat. 229 (2), 314-325 (2016).
  38. Wong, R., Geyer, S., Weninger, W., Guimberteau, J. C., Wong, J. K. The dynamic anatomy and patterning of skin. Exp Dermatol. 25 (2), 92-98 (2016).
  39. Jenner, F., et al. The embryogenesis of the equine femorotibial joint: The equine interzone. Equine Vet J. 47 (5), 620-622 (2015).
  40. Wiedner, M., et al. Simultaneous dermal matrix and autologous split-thickness skin graft transplantation in a porcine wound model: a three-dimensional histological analysis of revascularization. Wound Repair Regen. 22 (6), 749-754 (2014).
  41. Mohun, T., et al. Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders (DMDD): a new programme for phenotyping embryonic lethal mice. Dis Model Mech. 6 (3), 562-566 (2013).
  42. Wilson, R., et al. Highly variable penetrance of abnormal phenotypes in embryonic lethal knockout mice. Wellcome Open Res. 1, 1 (2016).
  43. Wilson, R., McGuire, C., Mohun, T. Deciphering the mechanisms of developmental disorders: phenotype analysis of embryos from mutant mouse lines. Nucleic Acids Res. 44 (D1), D855-D861 (2016).
  44. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  45. Pieles, G., et al. microMRI-HREM pipeline for high-throughput, high-resolution phenotyping of murine embryos. J Anat. 211 (1), 132-137 (2007).
  46. Weninger, W. J., Geyer, S. H. Episcopic 3D Imaging Methods: Tools for Researching Gene Function. Curr Genomics. 9, 282-289 (2008).
  47. . Deciphering the Mechanisms of Developmental Disorders: DMDD Available from: https://dmdd.org.uk/ (2017)

Tags

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM)Organic Materials3D AnalysisVisualizationBiomedical ResearchDehydrationInfiltrationEmbeddingVolume DataModel OrganismsWound Healing

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Diesen Artikel zitieren
Geyer, S. H., Maurer-Gesek, B., Reissig, L. F., Weninger, W. J. High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) – Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials. J. Vis. Exp. (125), e56071, doi:10.3791/56071 (2017).
Zitat herunterladen
Nachdrucke und Berechtigungen

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image