Här presenterar vi en pålitlig och enkel analys för att mäta glykogeninnehållet i cyanobakteriella celler. Förfarandet medför utfällning, selekterbar depolymerisation och detektering av glukosrester. Denna metod är lämplig för både vildtyp och genetiskt manipulerade stammar och kan underlätta den metaboliska verkningen av cyanobakterier.
Cyanobakterier ackumulerar glykogen som ett stort intracellulärt kol- och energilagring under fotosyntesen. Den senaste utvecklingen inom forskning har framhävt komplexa mekanismer för glykogenmetabolism, inklusive dielcykeln för biosyntes och katabolism, redoxreglering och involvering av icke-kodande RNA. Samtidigt görs ansträngningar för att omdirigera kol från glykogen till önskvärda produkter i genetiskt manipulerade cyanobakterier för att förbättra produktutbytet. Flera metoder används för att bestämma glykogeninnehållet i cyanobakterier, med varierande noggrannhet och tekniska komplexiteter. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för pålitlig bestämning av glykogenhalten i cyanobakterier som kan utföras i ett standardvetenskapligt laboratorium. Protokollet innefattar selektiv utfällning av glykogen från celllysatet och den enzymatiska depolymerisationen av glykogen för att alstra glukosmonomerer som detekteras av en glukosoxIdase-peroxidas (GOD-POD) enzymkopplad analys. Metoden har applicerats på Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002, två modeller cyanobakteriella arter som används i stor utsträckning inom ämnesmetodik. Vidare visade metoden framgångsrikt skillnader i glykogeninnehållet mellan vildtypen och mutanterna defekta i regulatoriska element eller glykogenbiosyntetiska gener.
Cyanobakterier ackumulerar glykogen som den största kolhydratlagret av kol från CO 2 fixerad i ljus genom fotosyntes. Glykogen är en glykan bestående av linjär a-1,4-kopplad glukan med grenar skapade av a-1,6-länkade glukosylbindningar. Glykogenbiosyntes i cyanobakterier börjar med omvandlingen av glukos-6-fosfat till ADP-glukos genom sekventiell verkan av fosfoglukomutas och ADP-glukospyrofosforylas. Glukosdelen i ADP-glukos överförs till den icke-reducerande änden av a-1,4-glukan-ryggraden av glykogen med en eller flera glykogensyntaser (GlgA). Därefter introducerar en förgreningsenzymer den a-1,6-bundna glukosylbindningen, vilken vidare förlängs för att generera glykogenpartikeln. I mörkret bryts ned glykogen av glykogenfosforylas, glykogenförgreningsenzymer, a-glukanotransferas och maltodextrinfosforylas i fosforylerad glukos och fri glukos. Dessa foder intO kataboliska vägar, inklusive oxidativ pentosfosfatvägen, Embden-Meyerhof-Parnas-vägen (glykolys) och Entner-Doudoroff-vägen 1 , 2 , 3 , 4 .
Glykogenmetabolism i cyanobakterier har ökat intresse för de senaste åren på grund av att cyanobakterierna kan utvecklas till mikrobiella cellfabriker drivna av solljus för att producera kemikalier och bränslen. Glykogenmetabolism kan modifieras för att öka utbytet av produkterna, eftersom glykogen är den största flexibla kolpumpen i dessa bakterier. Ett exempel är cyanobakteriet Synechococcus sp. PCC 7002, som har blivit genetiskt konstruerad för att producera mannitol; Den genetiska störningen av glykogensyntes ökar mannitolutbytet 3 gånger 5 . Ett annat exempel är produktionen av bioetanol från glykogenbelastad vildYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Glykogenhalten av vildtypscell kan vara upp till 60% av cellens torrvikt under kvävehushållning 6 .
Vår förståelse av glykogenmetabolism och reglering har också ökat de senaste åren. Medan glykogen är känd för att ackumuleras i ljuset och kataboliseras i mörker, avslöts detaljerad kinetik av glykogenmetabolism under dielcykeln först nyligen i Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Dessutom har flera gener som påverkar ackumuleringen av glykogen identifierats. Ett anmärkningsvärt exempel är upptäckten att det förmodade histidinkinaset PmgA och det icke-kodande RNA PmgRl bildar en regulatorisk kaskad och kontrollerar ackumuleringen av glykogen. Intressant ackumulerar pmgA- och pmgRl- deletionsmutanterna dubbelt så mycket glykogen som vildtypstammen av Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Andra regleringselement är också kända för att påverka ackumulationen av glykogen, inkluderande den alternativa sigmafaktorn E och transkriptionsfaktorn CyAbrB2 10 , 11 .
Eftersom intresset för glykogenreglering och metabolism växer, är ett detaljerat protokoll som beskriver bestämningen av glykogeninnehållet motiverat. Flera metoder används i litteraturen. Syrahydrolys följt av bestämning av monosackaridhalten genom högtrycksanjonbytningsvätskekromatografi kopplad med en pulserad amperometrisk detektor eller spektrometrisk bestämning efter behandlingar med syra och fenol är allmänt använda metoder för att approximera glykogenhalten 9 , 10 , 12 , 13 . Emellertid en högtrycksanjonbyte vätskekromatografiC-instrumentet är mycket dyrt och diskriminerar inte glukos härledd från glykogen från det som härrör från andra glukosinnehållande glykokonjugat, såsom sackaros 14 , glukosylglycerol 15 och cellulosa 16 , 17 , 18 , vilka är kända att ackumulera i vissa cyanobakteriella arter. Syra-fenolmetoden kan utföras med standard laboratorieutrustning. Det använder emellertid högtoxiska reagens och skiljer inte glukos härledd från olika glykokonjugat, och skiljer inte heller glukos från andra monosackarider som utgör cellulära material, såsom glykolipider, lipopolysackarider och extracellulära matriser 12 . Speciellt används den heta syren-fenolanalysen ofta för bestämning av total kolhydrathalt i stället för för bestämning av glukoshalt 12 . Enzymatisk hyDrolys av glykogen till glukos genom a-amyloglukosidas följt av detektering av glukos genom en enzymkopplad analys alstrar en kolorimetrisk avläsning som är mycket känslig och specifik för glukos härledd från glykogen. Specificiteten kan förbättras ytterligare med preferentiell utfällning av glykogen från celllysat med etanol 5 , 8 , 19 .
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en enzymbaserad analys av glykogenhalten i två av de mest studerade cyanobakteriella arterna, Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002, i vildtyp och mutantstammar. För att säkerställa effektiv hydrolys användes en cocktail av a-amylas och a-amyloglukosidas 8 . Det endo-verkande a-amylaset hydrolyserar a-1,4-bindningarna i olika glukaner i dextrin, som vidare hydrolyseras tO glukos genom exo-verkande a-amyloglukosidas 20 . De synergistiska effekterna av dessa enzymer är välkända, och dessa enzymer används rutinmässigt för selektiv hydrolys av stärkelse, som är en a-bunden glukanliknande glykogen, utan att påverka andra glykokonjuganter, såsom cellulosa, i växtbiomassan 21 . Den frisatta glukosen detekteras kvantitativt efter en enzymkopplad analys bestående av glukosoxidas som katalyserar reduktionen av syre till väteperoxid och oxidationen av glukos till en lakton- och peroxidas-som ger ett rosa färgat kinoniminfärg från väteperoxid, En fenolförening och 4-aminoantipyrin 22 .
Kritiska steg inom protokollet är glykogenutfällning och resuspendering. Efter centrifugering efter etanolutfällning bildar glykogen en genomskinlig pellet som löst fastnar vid väggarna i mikrocentrifugrören. När supernatanten avlägsnas måste därför särskild uppmärksamhet ges för att inte avlägsna pelleten. Glykogenpelleten är klibbig och solubilisering kan vara svårt om den torkar ut. Observera att fullständig solubilisering av glykogenpelleten är viktig eftersom ofullständig solubilisering leder ti…
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Nordic Energy Research (AquaFEED, projekt nr 24), Innovationfonden Danmark (Pant Power, projekt nr 12-131844) och Villum Fonden (projekt nr 13363)
QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |