Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobakterier ackumulerar glykogen som den största kolhydratlagret av kol från CO ₂ fixerad i ljus genom fotosyntes. Glykogen är en glykan bestående av linjär a-1,4-kopplad glukan med grenar skapade av a-1,6-länkade glukosylbindningar. Glykogenbiosyntes i cyanobakterier börjar med omvandlingen av glukos-6-fosfat till ADP-glukos genom sekventiell verkan av fosfoglukomutas och ADP-glukospyrofosforylas. Glukosdelen i ADP-glukos överförs till den icke-reducerande änden av a-1,4-glukan-ryggraden av glykogen med en eller flera glykogensyntaser (GlgA). Därefter introducerar en förgreningsenzymer den a-1,6-bundna glukosylbindningen, vilken vidare förlängs för att generera glykogenpartikeln. I mörkret bryts ned glykogen av glykogenfosforylas, glykogenförgreningsenzymer, a-glukanotransferas och maltodextrinfosforylas i fosforylerad glukos och fri glukos. Dessa foder intO kataboliska vägar, inklusive oxidativ pentosfosfatvägen, Embden-Meyerhof-Parnas-vägen (glykolys) och Entner-Doudoroff-vägen ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Glykogenmetabolism i cyanobakterier har ökat intresse för de senaste åren på grund av att cyanobakterierna kan utvecklas till mikrobiella cellfabriker drivna av solljus för att producera kemikalier och bränslen. Glykogenmetabolism kan modifieras för att öka utbytet av produkterna, eftersom glykogen är den största flexibla kolpumpen i dessa bakterier. Ett exempel är cyanobakteriet Synechococcus sp. PCC 7002, som har blivit genetiskt konstruerad för att producera mannitol; Den genetiska störningen av glykogensyntes ökar mannitolutbytet 3 gånger ⁵ . Ett annat exempel är produktionen av bioetanol från glykogenbelastad vildYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Glykogenhalten av vildtypscell kan vara upp till 60% av cellens torrvikt under kvävehushållning ⁶ .

Vår förståelse av glykogenmetabolism och reglering har också ökat de senaste åren. Medan glykogen är känd för att ackumuleras i ljuset och kataboliseras i mörker, avslöts detaljerad kinetik av glykogenmetabolism under dielcykeln först nyligen i Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Dessutom har flera gener som påverkar ackumuleringen av glykogen identifierats. Ett anmärkningsvärt exempel är upptäckten att det förmodade histidinkinaset PmgA och det icke-kodande RNA PmgRl bildar en regulatorisk kaskad och kontrollerar ackumuleringen av glykogen. Intressant ackumulerar pmgA- och pmgRl- deletionsmutanterna dubbelt så mycket glykogen som vildtypstammen av Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Andra regleringselement är också kända för att påverka ackumulationen av glykogen, inkluderande den alternativa sigmafaktorn E och transkriptionsfaktorn CyAbrB2 ^{10 , 11} .

Eftersom intresset för glykogenreglering och metabolism växer, är ett detaljerat protokoll som beskriver bestämningen av glykogeninnehållet motiverat. Flera metoder används i litteraturen. Syrahydrolys följt av bestämning av monosackaridhalten genom högtrycksanjonbytningsvätskekromatografi kopplad med en pulserad amperometrisk detektor eller spektrometrisk bestämning efter behandlingar med syra och fenol är allmänt använda metoder för att approximera glykogenhalten ^{9 , 10 , 12 , 13} . Emellertid en högtrycksanjonbyte vätskekromatografiC-instrumentet är mycket dyrt och diskriminerar inte glukos härledd från glykogen från det som härrör från andra glukosinnehållande glykokonjugat, såsom sackaros ¹⁴ , glukosylglycerol ¹⁵ och cellulosa ^{16 , 17 , 18} , vilka är kända att ackumulera i vissa cyanobakteriella arter. Syra-fenolmetoden kan utföras med standard laboratorieutrustning. Det använder emellertid högtoxiska reagens och skiljer inte glukos härledd från olika glykokonjugat, och skiljer inte heller glukos från andra monosackarider som utgör cellulära material, såsom glykolipider, lipopolysackarider och extracellulära matriser ¹² . Speciellt används den heta syren-fenolanalysen ofta för bestämning av total kolhydrathalt i stället för för bestämning av glukoshalt ¹² . Enzymatisk hyDrolys av glykogen till glukos genom a-amyloglukosidas följt av detektering av glukos genom en enzymkopplad analys alstrar en kolorimetrisk avläsning som är mycket känslig och specifik för glukos härledd från glykogen. Specificiteten kan förbättras ytterligare med preferentiell utfällning av glykogen från celllysat med etanol ^{5 , 8 , 19} .

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en enzymbaserad analys av glykogenhalten i två av de mest studerade cyanobakteriella arterna, Synechocystis sp. PCC 6803 och Synechococcus sp. PCC 7002, i vildtyp och mutantstammar. För att säkerställa effektiv hydrolys användes en cocktail av a-amylas och a-amyloglukosidas ⁸ . Det endo-verkande a-amylaset hydrolyserar a-1,4-bindningarna i olika glukaner i dextrin, som vidare hydrolyseras tO glukos genom exo-verkande a-amyloglukosidas ²⁰ . De synergistiska effekterna av dessa enzymer är välkända, och dessa enzymer används rutinmässigt för selektiv hydrolys av stärkelse, som är en a-bunden glukanliknande glykogen, utan att påverka andra glykokonjuganter, såsom cellulosa, i växtbiomassan ²¹ . Den frisatta glukosen detekteras kvantitativt efter en enzymkopplad analys bestående av glukosoxidas som katalyserar reduktionen av syre till väteperoxid och oxidationen av glukos till en lakton- och peroxidas-som ger ett rosa färgat kinoniminfärg från väteperoxid, En fenolförening och 4-aminoantipyrin ²² .