Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Las cianobacterias se acumulan glucógeno como el principal almacén de carbohidratos de carbono de CO ₂ fijado a la luz a través de la fotosíntesis. El glucógeno es un glicano que consiste en glucano enlazado con α-1,4 lineal con ramificaciones creadas por enlaces glucosilo unidos por α-1,6. La biosíntesis de glicógeno en cianobacterias comienza con la conversión de glucosa-6-fosfato en ADP-glucosa a través de la acción secuencial de fosfoglucomutasa y ADP-glucosa pirofosforilasa. El resto de glucosa en ADP-glucosa se transfiere al extremo no reductor del esqueleto de α-1,4-glucano de glucógeno por una o más glucógeno sintasas (GlgA). Posteriormente, las enzimas ramificadoras introducen el enlace glucosilo unido a 1,6, que se extiende adicionalmente para generar la partícula de glicógeno. En la oscuridad, el glucógeno se descompone por glucógeno fosforilasa, enzimas desramificantes de glucógeno, α-glucanotransferasa y malto-dextrina fosforilasa en glucosa fosforilada y glucosa libre. Estos int de alimentaciónO las vías catabólicas, incluida la vía oxidativa de pentosa fosfato, la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólisis) y la vía de Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

El metabolismo del glicógeno en las cianobacterias ha despertado un interés creciente en los últimos años debido a la posibilidad de que las cianobacterias se conviertan en fábricas de células microbianas impulsadas por la luz solar para producir productos químicos y combustibles. El metabolismo del glicógeno podría modificarse para aumentar el rendimiento de los productos, porque el glicógeno es el grupo de carbono flexible más grande de estas bacterias. Un ejemplo es la cianobacteria Synechococcus sp. PCC 7002, que ha sido genéticamente modificado para producir manitol; La interrupción genética de la síntesis de glucógeno aumenta el rendimiento de manitol 3 veces ⁵ . Otro ejemplo es la producción de bioetanol a partir de wildt cargado con glucógenoYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . El contenido de glucógeno de células de tipo salvaje puede ser hasta 60% del peso seco de la célula durante la inanición de nitrógeno ⁶ .

Nuestra comprensión del metabolismo del glucógeno y la regulación también se ha expandido en los últimos años. Aunque se sabe que el glucógeno se acumula a la luz y se cataboliza en la oscuridad, la cinética detallada del metabolismo del glucógeno durante el ciclo de diel fue revelada recientemente en Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Además, se han identificado varios genes que afectan a la acumulación de glucógeno. Un ejemplo notable es el descubrimiento de que la supuesta histidina quinasa PmgA y el ARN no codificante PmgR1 forman una cascada reguladora y controlan la acumulación de glucógeno. De manera interesante, los mutantes de deleción pmgA y pmgR1 acumulan el doble de glucógeno que la cepa de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Se sabe también que otros elementos reguladores afectan la acumulación de glucógeno, incluyendo el factor sigma E alternativo y el factor transcripcional CyAbrB2 ^{10 , 11} .

Como el interés en la regulación del glucógeno y el metabolismo crecen, un protocolo detallado que describe la determinación del contenido de glucógeno está garantizado. En la literatura se utilizan varios métodos. La hidrólisis ácida seguida por la determinación del contenido de monosacárido mediante cromatografía líquida de intercambio aniónico de alta presión acoplada con un detector amperométrico pulsado o determinación espectrométrica después de tratamientos con ácido y fenol son métodos ampliamente utilizados para aproximar el contenido de glucógeno ^{9 , 10 , 12 , 13} . Sin embargo, un cromatógrafo líquido de intercambio aniónico de alta presiónC es muy cara y no discrimina la glucosa derivada del glucógeno de la derivada de otros glicoconjugados que contienen glucosa, tales como la sacarosa ¹⁴ , el glucosilglicerol ¹⁵ y la celulosa ^{16 , 17 , 18} , que se sabe que se acumulan en algunas especies de cianobacterias. El método ácido-fenol se puede realizar utilizando equipo de laboratorio estándar. Sin embargo, utiliza reactivos altamente tóxicos y no distingue glucosa derivada de diferentes glicoconjugados, ni distingue glucosa de otros monosacáridos que constituyen materiales celulares, como glicolípidos, lipopolisacáridos y matrices extracelulares ¹² . En particular, el ensayo ácido-fenol caliente se utiliza a menudo para la determinación del contenido total de hidratos de carbono más que para la determinación específica del contenido de glucosa ¹² . Enzymatic hyLa hidrólisis de glicógeno a glucosa por α-amiloglucosidasa seguida por la detección de glucosa a través de un ensayo acoplado a enzima genera una lectura colorimétrica que es altamente sensible y específica a glucosa derivada de glucógeno. La especificidad puede mejorarse adicionalmente con la precipitación preferencial de glucógeno a partir de lisados ​​celulares por etanol ^{5 , 8 , 19} .

Aquí, describimos un protocolo detallado para un ensayo basado en enzimas del contenido de glucógeno en dos de las especies de cianobacterias más estudiadas, Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, en el tipo salvaje y cepas mutantes. Con el fin de garantizar la hidrólisis eficiente, un cóctel de α-amilasa y α-amiloglucosidasa se utiliza [ ^8] . La alpha – amilasa que actúa endo hidroliza los enlaces alpha – 1,4 en diversos glucanos en dextrinas, que se hidrolizan adicionalmente tO de glucosa mediante la α-amiloglucosidasa exoactiva ²⁰ . Los efectos sinérgicos de estas enzimas son bien conocidos, y estas enzimas se utilizan rutinariamente para la hidrólisis selectiva del almidón, que es un glucano α-ligado como el glucógeno, sin afectar a otros glicoconjugantes, como la celulosa, en la biomasa vegetal ²¹ . La glucosa liberada se detecta cuantitativamente después de un ensayo acoplado a enzima que consiste en glucosa oxidasa, que cataliza la reducción de oxígeno en peróxido de hidrógeno y la oxidación de glucosa en lactona y peroxidasa, lo que produce un colorante quinoneimina rosado a partir de peróxido de hidrógeno, Un compuesto fenólico y 4-aminoantipirina ²² .