Здесь мы представляем надежный и простой анализ для измерения содержания гликогена в клетках цианобактерий. Процедура влечет за собой осаждение, селективную деполимеризацию и обнаружение остатков глюкозы. Этот метод подходит как для дикого типа, так и для генетически модифицированных штаммов и может способствовать метаболической инженерии цианобактерий.
Цианобактерии накапливают гликоген в качестве основного внутриклеточного углерода и энергии при фотосинтезе. Недавние разработки в области исследований выявили сложные механизмы метаболизма гликогена, в том числе цикл циклов биосинтеза и катаболизма, окислительно-восстановительную регуляцию и участие некодирующей РНК. В то же время предпринимаются усилия по перенаправлению углерода из гликогена в желаемые продукты в генно-инженерных цианобактериях для повышения выхода продукта. Для определения содержания гликогена в цианобактериях используются несколько методов с переменной точностью и техническими сложностями. Здесь мы приводим подробный протокол для надежного определения содержания гликогена в цианобактериях, который может быть выполнен в стандартной лабораторной лаборатории. Протокол влечет за собой селективное осаждение гликогена из клеточного лизата и ферментативную деполимеризацию гликогена с образованием глюкозных мономеров, которые обнаруживаются у глюкозыIdase-peroxidase (GOD-POD), связанный с ферментом. Этот метод применяется к Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002, две модели цианобактериальных видов, которые широко используются в метаболической инженерии. Кроме того, метод успешно показал различия в содержании гликогена между диким типом и мутантами, дефектными в регуляторных элементах или генах биосинтеза гликогена.
Цианобактерии накапливают гликоген в качестве основного углеводного хранилища углерода из СО 2, закрепленного в свете путем фотосинтеза. Гликоген представляет собой гликан, состоящий из линейного α-1,4-связанного глюкана с ответвлениями, образованными α-1,6-связанными глюкозильными связями. Биосинтез гликогена в цианобактериях начинается с превращения глюкозо-6-фосфата в ADP-глюкозу посредством последовательного действия фосфоглюкомутазы и АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы. Глюкозную часть в ADP-глюкозе переносят на невосстанавливающий конец α-1,4-глюкан-скелета гликогена одной или несколькими гликогенсинтазами (GlgA). Впоследствии разветвляющиеся ферменты вводят α-1,6-связанное глюкозильное звено, которое далее расширяется, чтобы генерировать гликогенную частицу. В темноте гликоген разрушается гликогенфосфорилазой, гликогенными дебранирующими ферментами, α-глюканотрансферазой и мальтодекстринфосфорилазой в фосфорилированную глюкозу и свободную глюкозу. Эти фиды intO катаболические пути, включая окислительный пентозофосфатный путь, путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса (гликолиз) и путь Энтерна-Дудорова 1 , 2 , 3 , 4 .
В последние годы метаболизм гликогена в цианобактериях вызвал повышенный интерес из-за возможности развития цианобактерий в заводы микробиологических клеток, вызванных солнечным светом, для производства химических веществ и топлива. Метаболизм гликогена можно модифицировать, чтобы увеличить выход продуктов, поскольку гликоген является самым большим гибким углеродным пулом в этих бактериях. Примером может служить cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, который был генетически разработан для производства маннита; Генетический разрыв синтеза гликогена увеличивает выход маннита в 3 раза 5 . Другим примером является производство биоэтанола из загруженного гликогенами дикогоYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Содержание гликогена в клеточном слое дикого типа может составлять до 60% от сухой массы клетки во время голодания азота 6 .
Наше понимание метаболизма и регуляции гликогена также расширилось за последние годы. Хотя известно, что гликоген накапливается в свете и катаболизируется в темноте, детальная кинетика метаболизма гликогена во время цикла диэлей была недавно обнаружена только в Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Кроме того, было выявлено несколько генов, влияющих на накопление гликогена. Примечательным примером является открытие, что предполагаемая гистидинкиназа PmgA и некодирующая РНК PmgR1 образуют регуляторный каскад и контролируют накопление гликогена. Интересно, что мутанты делеции pmgA и pmgR1 накапливают в два раза больше гликогена, чем штамм дикого типа Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Известно, что другие регуляторные элементы влияют на накопление гликогена, включая альтернативный сигма-фактор E и транскрипционный фактор CyAbrB2 10 , 11 .
По мере роста интереса к регуляции гликогена и метаболизма необходим подробный протокол, описывающий определение содержания гликогена. В литературе используются несколько методов. Кислотный гидролиз с последующим определением содержания моносахарида посредством анионообменной жидкостной хроматографии под высоким давлением в сочетании с импульсным амперометрическим детектором или спектрометрическим определением после обработки кислотой и фенолом являются широко используемыми методами для аппроксимации содержания гликогена 9 , 10 , 12 , 13 . Однако анион-обменный жидкостной хроматограф высокого давленияC является очень дорогостоящим и не выделяет глюкозу, полученную из гликогена, по сравнению с другими глюкозосодержащими гликоконъюгатами, такими как сахароза 14 , глюкозилглицерин 15 и целлюлоза 16 , 17 , 18 , которые, как известно, накапливаются у некоторых видов цианобактерий. Кислотно-фенольный метод может быть выполнен с использованием стандартного лабораторного оборудования. Тем не менее, он использует высоко токсичные реагенты и не различает глюкозу , полученную из различных гликоконъюгатов, а также не различают глюкозы из других моносахаридов , которые представляют собой клеточные материалы, такие как гликолипиды, липополисахариды и внеклеточные матрицы 12. В частности, анализ горячей кислоты-фенола часто используется для определения общего содержания углеводов, а не для конкретного определения содержания глюкозы 12 . ФерментативныйДролиз гликогена до глюкозы посредством α-амилоглюкозидазы с последующим детектированием глюкозы через фермент-связанный анализ генерирует колориметрическое считывание, которое является высокочувствительным и специфичным для глюкозы, полученной из гликогена. Специфичность может быть дополнительно улучшена с предпочтительным осаждением гликогена из клеточных лизатов с помощью этанола 5 , 8 , 19 .
Здесь мы опишем подробный протокол для анализа содержания гликогена на основе фермента на двух наиболее широко изученных цианобактериальных видах Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002, в штаммах дикого типа и мутантов. Для обеспечения эффективного гидролиза используется коктейль α-амилазы и α-амилоглюкозидазы 8 . Эндо-действующая α-амилаза гидролизует α-1,4-связи в различных глюканах в декстрины, которые далее гидролизуются tO глюкозой экзо-действующей α-амилоглюкозидазой 20 . Синергические эффекты этих ферментов хорошо известны, и эти ферменты обычно используются для селективного гидролиза крахмала, который является α-связанным глюканоподобным гликогеном, не влияя на другие гликоконъюганты, такие как целлюлоза, в биомассе растений 21 . Выделенная глюкоза количественно обнаруживается после анализа, связанного с ферментом, состоящего из глюкозооксидазы, которая катализирует восстановление кислорода до перекиси водорода и окисление глюкозы до лактона и пероксидазы, которая продуцирует хинонимин-краситель розового цвета из перекиси водорода, Фенольное соединение и 4-аминоантипирин 22 .
Критические шаги в протоколе – это осаждение гликогена и ресуспензия. После центрифугирования после осаждения этанолом гликоген образует полупрозрачную таблетку, которая свободно прилипает к стенкам микроцентрифужных пробирок. Поэтому при удалении надосадочной жидкости необходимо…
The authors have nothing to disclose.
Авторы признают, что Nordic Energy Research (AquaFEED, проект № 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, проект № 12-131844) и Villum Fonden (проект № 13363)
QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |