Определение содержания гликогена в цианобактериях

Цианобактерии накапливают гликоген в качестве основного углеводного хранилища углерода из СО _2, закрепленного в свете путем фотосинтеза. Гликоген представляет собой гликан, состоящий из линейного α-1,4-связанного глюкана с ответвлениями, образованными α-1,6-связанными глюкозильными связями. Биосинтез гликогена в цианобактериях начинается с превращения глюкозо-6-фосфата в ADP-глюкозу посредством последовательного действия фосфоглюкомутазы и АДФ-глюкозо-пирофосфорилазы. Глюкозную часть в ADP-глюкозе переносят на невосстанавливающий конец α-1,4-глюкан-скелета гликогена одной или несколькими гликогенсинтазами (GlgA). Впоследствии разветвляющиеся ферменты вводят α-1,6-связанное глюкозильное звено, которое далее расширяется, чтобы генерировать гликогенную частицу. В темноте гликоген разрушается гликогенфосфорилазой, гликогенными дебранирующими ферментами, α-глюканотрансферазой и мальтодекстринфосфорилазой в фосфорилированную глюкозу и свободную глюкозу. Эти фиды intO катаболические пути, включая окислительный пентозофосфатный путь, путь Эмбдена-Мейерхофа-Парнаса (гликолиз) и путь Энтерна-Дудорова ^{1 , 2 , 3 , 4} .

В последние годы метаболизм гликогена в цианобактериях вызвал повышенный интерес из-за возможности развития цианобактерий в заводы микробиологических клеток, вызванных солнечным светом, для производства химических веществ и топлива. Метаболизм гликогена можно модифицировать, чтобы увеличить выход продуктов, поскольку гликоген является самым большим гибким углеродным пулом в этих бактериях. Примером может служить cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, который был генетически разработан для производства маннита; Генетический разрыв синтеза гликогена увеличивает выход маннита в 3 раза ⁵ . Другим примером является производство биоэтанола из загруженного гликогенами дикогоYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Содержание гликогена в клеточном слое дикого типа может составлять до 60% от сухой массы клетки во время голодания азота ⁶ .

Наше понимание метаболизма и регуляции гликогена также расширилось за последние годы. Хотя известно, что гликоген накапливается в свете и катаболизируется в темноте, детальная кинетика метаболизма гликогена во время цикла диэлей была недавно обнаружена только в Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Кроме того, было выявлено несколько генов, влияющих на накопление гликогена. Примечательным примером является открытие, что предполагаемая гистидинкиназа PmgA и некодирующая РНК PmgR1 образуют регуляторный каскад и контролируют накопление гликогена. Интересно, что мутанты делеции pmgA и pmgR1 накапливают в два раза больше гликогена, чем штамм дикого типа Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Известно, что другие регуляторные элементы влияют на накопление гликогена, включая альтернативный сигма-фактор E и транскрипционный фактор CyAbrB2 ^{10 , 11} .

По мере роста интереса к регуляции гликогена и метаболизма необходим подробный протокол, описывающий определение содержания гликогена. В литературе используются несколько методов. Кислотный гидролиз с последующим определением содержания моносахарида посредством анионообменной жидкостной хроматографии под высоким давлением в сочетании с импульсным амперометрическим детектором или спектрометрическим определением после обработки кислотой и фенолом являются широко используемыми методами для аппроксимации содержания гликогена ^{9 , 10 , 12 , 13} . Однако анион-обменный жидкостной хроматограф высокого давленияC является очень дорогостоящим и не выделяет глюкозу, полученную из гликогена, по сравнению с другими глюкозосодержащими гликоконъюгатами, такими как сахароза ¹⁴ , глюкозилглицерин ¹⁵ и целлюлоза ^{16 , 17 , 18} , которые, как известно, накапливаются у некоторых видов цианобактерий. Кислотно-фенольный метод может быть выполнен с использованием стандартного лабораторного оборудования. Тем не менее, он использует высоко токсичные реагенты и не различает глюкозу , полученную из различных гликоконъюгатов, а также не различают глюкозы из других моносахаридов , которые представляют собой клеточные материалы, такие как гликолипиды, липополисахариды и внеклеточные матрицы ^12. В частности, анализ горячей кислоты-фенола часто используется для определения общего содержания углеводов, а не для конкретного определения содержания глюкозы ¹² . ФерментативныйДролиз гликогена до глюкозы посредством α-амилоглюкозидазы с последующим детектированием глюкозы через фермент-связанный анализ генерирует колориметрическое считывание, которое является высокочувствительным и специфичным для глюкозы, полученной из гликогена. Специфичность может быть дополнительно улучшена с предпочтительным осаждением гликогена из клеточных лизатов с помощью этанола ^{5 , 8 , 19} .

Здесь мы опишем подробный протокол для анализа содержания гликогена на основе фермента на двух наиболее широко изученных цианобактериальных видах Synechocystis sp. PCC 6803 и Synechococcus sp. PCC 7002, в штаммах дикого типа и мутантов. Для обеспечения эффективного гидролиза используется коктейль α-амилазы и α-амилоглюкозидазы ⁸ . Эндо-действующая α-амилаза гидролизует α-1,4-связи в различных глюканах в декстрины, которые далее гидролизуются tO глюкозой экзо-действующей α-амилоглюкозидазой ²⁰ . Синергические эффекты этих ферментов хорошо известны, и эти ферменты обычно используются для селективного гидролиза крахмала, который является α-связанным глюканоподобным гликогеном, не влияя на другие гликоконъюганты, такие как целлюлоза, в биомассе растений ²¹ . Выделенная глюкоза количественно обнаруживается после анализа, связанного с ферментом, состоящего из глюкозооксидазы, которая катализирует восстановление кислорода до перекиси водорода и окисление глюкозы до лактона и пероксидазы, которая продуцирует хинонимин-краситель розового цвета из перекиси водорода, Фенольное соединение и 4-аминоантипирин ²² .