Determinazione del contenuto di glicogeno nei cianobatteri

I cianobatteri accumulano glicogeno come il principale deposito di carboidrati del carbonio da CO ₂ fissato alla luce attraverso la fotosintesi. Il glicogeno è un glicano costituito da glucano lineare α-1,4 collegato con rami creati da legami glucosilici legati al α-1,6. La biosintesi dei glicogeni nei cianobatteri inizia con la conversione di glucosio-6-fosfato in glucosio ADP attraverso l'azione sequenziale di fosfoglucomutasi e di pirosfosforilasi di glucosio ADP. La parte del glucosio in glucosio ADP viene trasferita all'estremità non riducente del globulo di α-1,4-glucano del glicogeno mediante una o più sintasi glicogene (GlgA). Successivamente, un enzimi ramificanti introducono il legame glucosilico legato al α-1,6, che viene ulteriormente esteso per generare la particella del glicogeno. Nel buio, il glicogeno viene suddiviso in glicogeno fosforilasi, enzimi di gengogeno debrange, α-glucanotransferasi e fosforilasi di malto-dextrina in glucosio fosforilato e glucosio libero. Questi feed intPercorsi catabolici, compreso il percorso ossidativo del fosfato pentoso, il percorso Embden-Meyerhof-Parnas (glicolisi) e il percorso Entner-Doudoroff ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Il metabolismo dei glicogeni nei cianobatteri ha riscosso un crescente interesse negli ultimi anni a causa del potenziale per i cianobatteri a svilupparsi in fabbriche di cellule microbiche azionate dalla luce solare per produrre sostanze chimiche e combustibili. Il metabolismo del glicogeno potrebbe essere modificato per aumentare la resa dei prodotti, perché il glicogeno è la più grande raccolta di carbonio flessibile in questi batteri. Un esempio è il cianobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, che è stato progettato geneticamente per produrre mannitolo; La rottura genetica della sintesi del glicogeno aumenta la resa del mannitolo 3 volte ⁵ . Un altro esempio è la produzione di bioetanolo da glicogeno-caricato wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 ⁶ . Il contenuto di glicogeno delle cellule di tipo selvatico può essere fino al 60% del peso secco della cellula durante la fame di azoto ⁶ .

La nostra comprensione del metabolismo e della regolazione del glicogeno si è ulteriormente ampliata negli ultimi anni. Mentre il glicogeno è noto per accumulare alla luce e per essere catabolizzato nella buia, la cinetica dettagliata del metabolismo del glicogeno durante il ciclo di diel è stata solo recentemente rivelata in Synechocystis sp. PCC 6803 ⁷ . Inoltre, sono stati identificati diversi geni che influenzano l'accumulo di glicogeno. Un esempio notevole è la scoperta che l'istidina kinasi PmgA e l'RNA non codificante PmgR1 formano una cascata regolatrice e controllano l'accumulo di glicogeno. È interessante notare che i mutanti di delezione pmgA e pmgR1 accumulano due volte il maggior numero di glicogeni come il ceppo selvatico di Synechocystis sp. PCC 68038 ^{, 9} . Altri elementi regolatori sono noti anche per influenzare l'accumulo di glicogeno, compreso il fattore sigma alternativo E e il fattore trascrizionale CyAbrB2 ^{10 , 11} .

Poiché l'interesse per la regolazione del glicogeno e il metabolismo cresce, è garantito un protocollo dettagliato che descrive la determinazione del contenuto di glicogeno. Diversi metodi sono usati nella letteratura. L'idrolisi acida seguita dalla determinazione del contenuto di monosaccharide mediante cromatografia liquida a scambio ad anione ad alta pressione accoppiata con un rilevatore amperometrico a pulsazione o una determinazione spettrometrica dopo trattamenti con acido e fenolo sono ampiamente utilizzati per approssimare il contenuto di glicogeno ^{9 , 10 , 12 , 13} . Tuttavia, un cromatografo liquido di scambio anionico ad alta pressioneC è molto costoso e non discrimina il glucosio derivato dal glicogeno da quello derivato da altri glicoconjugati contenenti glucosio, come la saccarosio ¹⁴ , il glucosilglicerolo ¹⁵ e la cellulosa ^{16 , 17 , 18} , notoriamente accumulati in alcune specie di cianobatteri. Il metodo acido-fenolo può essere eseguito utilizzando attrezzature standard di laboratorio. Tuttavia, utilizza reagenti altamente tossici e non distingue il glucosio derivato da diversi glicoconjugati, né distingue il glucosio da altri monosaccharidi che costituiscono materiali cellulari, come i glicolipidi, i liposolucaridi e le matrici extracellulari ¹² . In particolare, il saggio acido-fenolo caldo viene spesso utilizzato per la determinazione del contenuto totale di carboidrati anziché per la determinazione specifica del tenore di glucosio ¹² . Ili enzimaticiLa drolicosi del glicogeno al glucosio da parte di α-amiloglucosidasi seguita dalla rilevazione del glucosio attraverso un dosaggio accoppiato enzima genera una lettura colorimetrica altamente sensibile e specifica al glucosio derivato dal glicogeno. La specificità può essere ulteriormente migliorata con la precipitazione preferenziale di glicogeno da cellule lisati mediante etanolo ^{5 , 8 , 19} .

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per un dosaggio enzimatico del contenuto di glicogeno in due delle specie cianobatteriche più diffuse, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nelle specie selvatiche e mutanti. Al fine di garantire un'idrolisi efficiente, viene utilizzato un cocktail di α-amilasi e α-amiloglucosidasi ⁸ . L'α-amilasi ad azione endo idrolizza i legami α-1,4 in vari glucani in dextrine, che vengono ulteriormente idrolizzatiO glucosio mediante eso-azione α-amyloglucosidase ²⁰ . Gli effetti sinergici di questi enzimi sono ben noti e questi enzimi vengono utilizzati abitualmente per l'idrolisi selettiva dell'amido, che è un glicogeno a glucano associato a α, senza influenzare altri glicoconjuganti, come la cellulosa, nella biomassa vegetale ²¹ . Il glucosio rilasciato viene rilevato quantitativamente in seguito a un dosaggio enzimatico composto da glucosio ossidasi che catalizza la riduzione dell'ossigeno al perossido di idrogeno e l'ossidazione del glucosio a un lattone e alla perossidasi che produce un colorante quinoneimina rosa colorato di perossido di idrogeno, Un composto fenolico e 4-aminoantipirina ²² .