Qui presentiamo un test affidabile e facile per misurare il contenuto di glicogeno nelle cellule cianobatteriche. La procedura prevede precipitazione, depolimerizzazione selezionabile e rilevazione di residui di glucosio. Questo metodo è adatto sia per ceppi selvatici che geneticamente modificati e può facilitare l'ingegnerizzazione metabolica dei cianobatteri.
I cianobatteri accumulano il glicogeno come un importante deposito intracellulare di carbonio e di energia durante la fotosintesi. I recenti sviluppi della ricerca hanno evidenziato meccanismi complessi di metabolismo del glicogeno, compreso il ciclo di biosintesi e catabolismo, la regolazione redox e il coinvolgimento di RNA non codificante. Allo stesso tempo, si stanno tentando di reindirizzare il carbonio dal glicogeno a prodotti desiderabili in cianobatteri geneticamente modificati per migliorare le rese dei prodotti. Diversi metodi sono usati per determinare il contenuto di glicogeno nei cianobatteri, con precisione variabile e complessità tecnica. Qui forniamo un protocollo dettagliato per la determinazione affidabile del contenuto di glicogeno nei cianobatteri che può essere eseguito in un laboratorio di vita standard. Il protocollo prevede la precipitazione selettiva di glicogeno dal lisato cellulare e la depolimerizzazione enzimatica del glicogeno per generare monomeri di glucosio, rilevati da un gatto di glucosioIdase-perossidasi (GOD-POD). Il metodo è stato applicato a Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, due specie cianobatteriche di modello che sono ampiamente utilizzate nell'ingegneria metabolica. Inoltre, il metodo ha dimostrato con successo le differenze nel contenuto di glicogeni tra il tipo selvatico e mutanti difettosi in elementi regolatori o geni biosintetici al glicogeno.
I cianobatteri accumulano glicogeno come il principale deposito di carboidrati del carbonio da CO 2 fissato alla luce attraverso la fotosintesi. Il glicogeno è un glicano costituito da glucano lineare α-1,4 collegato con rami creati da legami glucosilici legati al α-1,6. La biosintesi dei glicogeni nei cianobatteri inizia con la conversione di glucosio-6-fosfato in glucosio ADP attraverso l'azione sequenziale di fosfoglucomutasi e di pirosfosforilasi di glucosio ADP. La parte del glucosio in glucosio ADP viene trasferita all'estremità non riducente del globulo di α-1,4-glucano del glicogeno mediante una o più sintasi glicogene (GlgA). Successivamente, un enzimi ramificanti introducono il legame glucosilico legato al α-1,6, che viene ulteriormente esteso per generare la particella del glicogeno. Nel buio, il glicogeno viene suddiviso in glicogeno fosforilasi, enzimi di gengogeno debrange, α-glucanotransferasi e fosforilasi di malto-dextrina in glucosio fosforilato e glucosio libero. Questi feed intPercorsi catabolici, compreso il percorso ossidativo del fosfato pentoso, il percorso Embden-Meyerhof-Parnas (glicolisi) e il percorso Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 .
Il metabolismo dei glicogeni nei cianobatteri ha riscosso un crescente interesse negli ultimi anni a causa del potenziale per i cianobatteri a svilupparsi in fabbriche di cellule microbiche azionate dalla luce solare per produrre sostanze chimiche e combustibili. Il metabolismo del glicogeno potrebbe essere modificato per aumentare la resa dei prodotti, perché il glicogeno è la più grande raccolta di carbonio flessibile in questi batteri. Un esempio è il cianobacterium Synechococcus sp. PCC 7002, che è stato progettato geneticamente per produrre mannitolo; La rottura genetica della sintesi del glicogeno aumenta la resa del mannitolo 3 volte 5 . Un altro esempio è la produzione di bioetanolo da glicogeno-caricato wildtYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . Il contenuto di glicogeno delle cellule di tipo selvatico può essere fino al 60% del peso secco della cellula durante la fame di azoto 6 .
La nostra comprensione del metabolismo e della regolazione del glicogeno si è ulteriormente ampliata negli ultimi anni. Mentre il glicogeno è noto per accumulare alla luce e per essere catabolizzato nella buia, la cinetica dettagliata del metabolismo del glicogeno durante il ciclo di diel è stata solo recentemente rivelata in Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Inoltre, sono stati identificati diversi geni che influenzano l'accumulo di glicogeno. Un esempio notevole è la scoperta che l'istidina kinasi PmgA e l'RNA non codificante PmgR1 formano una cascata regolatrice e controllano l'accumulo di glicogeno. È interessante notare che i mutanti di delezione pmgA e pmgR1 accumulano due volte il maggior numero di glicogeni come il ceppo selvatico di Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Altri elementi regolatori sono noti anche per influenzare l'accumulo di glicogeno, compreso il fattore sigma alternativo E e il fattore trascrizionale CyAbrB2 10 , 11 .
Poiché l'interesse per la regolazione del glicogeno e il metabolismo cresce, è garantito un protocollo dettagliato che descrive la determinazione del contenuto di glicogeno. Diversi metodi sono usati nella letteratura. L'idrolisi acida seguita dalla determinazione del contenuto di monosaccharide mediante cromatografia liquida a scambio ad anione ad alta pressione accoppiata con un rilevatore amperometrico a pulsazione o una determinazione spettrometrica dopo trattamenti con acido e fenolo sono ampiamente utilizzati per approssimare il contenuto di glicogeno 9 , 10 , 12 , 13 . Tuttavia, un cromatografo liquido di scambio anionico ad alta pressioneC è molto costoso e non discrimina il glucosio derivato dal glicogeno da quello derivato da altri glicoconjugati contenenti glucosio, come la saccarosio 14 , il glucosilglicerolo 15 e la cellulosa 16 , 17 , 18 , notoriamente accumulati in alcune specie di cianobatteri. Il metodo acido-fenolo può essere eseguito utilizzando attrezzature standard di laboratorio. Tuttavia, utilizza reagenti altamente tossici e non distingue il glucosio derivato da diversi glicoconjugati, né distingue il glucosio da altri monosaccharidi che costituiscono materiali cellulari, come i glicolipidi, i liposolucaridi e le matrici extracellulari 12 . In particolare, il saggio acido-fenolo caldo viene spesso utilizzato per la determinazione del contenuto totale di carboidrati anziché per la determinazione specifica del tenore di glucosio 12 . Ili enzimaticiLa drolicosi del glicogeno al glucosio da parte di α-amiloglucosidasi seguita dalla rilevazione del glucosio attraverso un dosaggio accoppiato enzima genera una lettura colorimetrica altamente sensibile e specifica al glucosio derivato dal glicogeno. La specificità può essere ulteriormente migliorata con la precipitazione preferenziale di glicogeno da cellule lisati mediante etanolo 5 , 8 , 19 .
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per un dosaggio enzimatico del contenuto di glicogeno in due delle specie cianobatteriche più diffuse, Synechocystis sp. PCC 6803 e Synechococcus sp. PCC 7002, nelle specie selvatiche e mutanti. Al fine di garantire un'idrolisi efficiente, viene utilizzato un cocktail di α-amilasi e α-amiloglucosidasi 8 . L'α-amilasi ad azione endo idrolizza i legami α-1,4 in vari glucani in dextrine, che vengono ulteriormente idrolizzatiO glucosio mediante eso-azione α-amyloglucosidase 20 . Gli effetti sinergici di questi enzimi sono ben noti e questi enzimi vengono utilizzati abitualmente per l'idrolisi selettiva dell'amido, che è un glicogeno a glucano associato a α, senza influenzare altri glicoconjuganti, come la cellulosa, nella biomassa vegetale 21 . Il glucosio rilasciato viene rilevato quantitativamente in seguito a un dosaggio enzimatico composto da glucosio ossidasi che catalizza la riduzione dell'ossigeno al perossido di idrogeno e l'ossidazione del glucosio a un lattone e alla perossidasi che produce un colorante quinoneimina rosa colorato di perossido di idrogeno, Un composto fenolico e 4-aminoantipirina 22 .
I punti critici all'interno del protocollo sono la precipitazione e la risospensione del glicogeno. Dopo la centrifugazione dopo la precipitazione dell'etanolo, il glicogeno forma un pallone traslucido che aderisce sciattamente alle pareti dei tubi di microcentrifuga. Pertanto, quando si rimuove il surnatante, è necessario prestare particolare attenzione per non rimuovere il pellet. Il pellet di glicogeno è appiccicoso e la solubilizzazione può essere difficile se si asciuga. Si noti che la solubilizzazione c…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori riconoscono la ricerca nordica dell'energia (AquaFEED, progetto n ° 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, progetto n ° 12-131844) e Villum Fonden (progetto n ° 13363)
QSonica Sonicators Q700 | Qsonica, LLC | NA | QSonica |
SpectraMax 190 Microplate Reader | Molecular Devices | NA | Eliza plate reader |
Bullet Blender Storm | Next Advance | BBY24M-CE | Beads beater |
Ultrospec 3100 pro UV/Visible Spectrophotometer | Amersham Biosciences | NA | Spectrophotometer |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | Buffer |
HCl | Merck | 1-00317 | pH adjutment |
Sodium acetate | Sigma-Aldrich | 32319 | Buffer |
Amyloglycosidase (Rhizopus sp.) | Megazyme | E-AMGPU | Enzyme for glycogen depolymerization |
α-Amylase, thermostable (Bacillus licheniformis) | Sigma-Aldrich | A3176 | Enzyme for glycogen depolymerization |
D-Glucose | Merch | 8337 | Standard for the glucose assay |
Pierce BCA Protein assay kit | Thermo Fisher scientific | 23225 | For determination of protein concentrations |
Aluminum drying trays, disposable | VWR | 611-1362 | For determination of cell dry weights |
D-Glucose assay kit (GODPOD format) | Megazyme | K-GLUC | For determination of glucose concentrations |
Zirconium oxide breads, 0.15 mm | Next Advance | ZrOB015 | Beads for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |
RINO tubes | Next Advance | NA | Tubes for cell lysis in a Bullet Blendar Storm |